利用體外受精－胚胎移植技術進行ALK3基因敲除小鼠的保種鑒定

陳通克，管敏強，陳錫文

(溫州醫學院實驗動物中心，浙江溫州325023)

基因敲除技術是20世紀80年代后半期應用DNA同源重組原理發展起來的。胚胎干細胞(ES細胞)分離和體外培養的成功及哺乳動物細胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的技術基礎和理論基礎［1］，但該模型的建立，需要投入大量的資金、人力和物力，又常常因一些人為或意外原因而丟失［2］。因此，建立一種快速、經濟、可靠的基因敲除動物種質保存方法尤為重要。為尋求一種適合于轉基因動物的較好保種技術，特進行本研究，供參考。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物 選用SPF級ALK3雌性小鼠及ALK3雄性小鼠作為體外受精供體，受體為SPF級ICR小鼠(合格證號為:SYXK(浙)2005－0061)。所有實驗用小鼠均在清潔級動物房飼養和繁殖，鼠齡6－8周，溫度控制在(20±2)℃，自動光控(L∶D=12 h∶12 h，光照起始時間為 7:00 －19:00)［3］，飲用新鮮自來水，飼喂混合干飼料。

1.2 試劑及儀器 孕馬血清(PMSG寧波市激素制品廠生產)、絨毛膜促性腺激素(HCG上海生物化學制藥廠生產)、礦物油、透明脂酸酶、HTF培養液為Sigma生產;DAP213 凍存液、1 mol/L DMSO、0.25 mol/L Sucrose由實驗室自行配制。

1.3 超排卵 ALK3雌性小鼠2只，注射PMSG 7.5 IU/只，48 h 后腹腔注射 HCG 7.5 IU/只，與已結扎雄鼠 1∶1同籠交配［4］。

1.4 體外受精 ALK3雄性小鼠頸椎脫臼法處死，收集兩側附睪尾，用顯微剪剪破附睪尾，用拇指和食指輕輕擠壓，用解剖針挑出精子，放于HTF液滴中，將精子滴皿放于CO2培養箱中培養(約1－2 h)。

ALK3雌性小鼠頸椎脫臼法處死，收集兩側輸卵管，放于濾紙上吸取表面水分及血絲，放于滴皿中的HTF旁，顯微鏡下觀察，用解剖針刺破膨大部，同時向外拉動(卵細胞從刺破口流出)，一直拉至HTF中，置于CO2培養箱中充分平衡。

取出經培養后的精子滴皿和卵子滴皿，用移液槍吸取10 μL精子加入卵子液滴中，每個大滴均加入精子10 μL，再置于CO2培養箱中培養。

1.5 胚胎收集 用自制移卵針挑選受精良好的2-cell至HTF液滴中，放入CO2培養箱中培養。

1.6 胚胎冷凍 將冷凍管(記錄標簽、品系、數量、細胞名稱、時間等)、DAP213置于恒溫金屬浴中，預冷至0℃。滴皿中滴入5滴DMSO(分別均為200 μL)。

2-cell受精卵冷凍:首先將2-cell受精卵放入200 μL DMSO液滴中(待320枚2-cell沉至底部時即可分裝)，洗后移入100 μL DMSO液滴(80枚/滴)中，再用5 μL移液槍一次性將胚胎轉移至冷凍管中，在恒溫金屬浴中靜置5 min后加入45 μL DAP213，再在恒溫金屬浴中靜置5 min后放入液氮罐中。

1.7 胚胎復蘇［5］從液氮罐中取出冷凍管，倒棄液氮，空氣中放置30 s后用移液槍加入0.9 mL 0.25 M蔗糖溶液，輕輕吹打10～15次，將管內液體移至滴皿中再用蔗糖清洗，將殘余2-cell移至滴皿中，在0.25 M蔗糖液滴旁滴入3滴KSOM，再用吸卵管從0.25 M蔗糖液滴中將2-cell移至KSOM中，洗3次后移至KSOM中置于CO2培養箱中靜置10 min后移植。

1.8 胚胎移植［6］2-cell胚胎的移植:用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉假孕母鼠，酒精消毒后剪除背臀部毛，于髂骨和腎臟下方剪一縱切口，引出卵巢、輸卵管、子宮，在靠近輸卵管小彎處剪口，將移卵管從小口處插入輸卵管，將受精卵吹入壺腹部，片刻后拔出。將卵巢、輸卵管、子宮復位，最后縫合創口，青霉素消炎。做好移植記錄卡片，精心飼養，記錄產仔日期、產仔數量等。

1.9 PCR檢測 從仔鼠尾部抽提基因組DNA進行PCR分析。

流程:在20體系中取1 μL DNA為模板，PCR檢測基因整合。

引物1:OVG 34:5'-TGA ATG AAC TGC AGG ACG AGG-3';

引物2:OVG 35:5'-AAG GTG AGA TGA CAG GAG ATC-3';

引物3:MHC-5:5'-ATG ACA GAC AGA TCC CTC CTA TCT CC-3';

引物4:Cre-3:5'-CTC ATC ACT CGT TGC ATC GAC-3'。

采用PCR擴增儀進行循環擴增:預變性，94℃5 min;變性，94℃ 1 min;退火，60℃ 1 min;延伸，72℃ 1 min，共38個循環，最后延伸10 min。PCR鑒定結果詳見圖1。

2 實驗結果

2.1 胚胎復蘇結果 2-cell冷凍保存前與經胚胎冷凍、復蘇后觀察其生長狀況，發現經復蘇后的2-cell除部分失去活力，兩者無顯著差異。冷凍前觀察到的2-cell如圖2所示。2.2 ALK3基因敲除小鼠胚胎冷凍復蘇結果 因ALK3基因敲除小鼠的純合子在11.5胚齡時死亡，因此出生時只有雜合子與基因缺失型小鼠［7］，凍存4管共計320枚，對4管進行胚胎復蘇，獲得存活胚胎96枚，復蘇率達30%，對其中80枚胚胎進行胚胎移植，產仔23只，平均產仔率為28.75%，對23對后代進行PCR基因鑒定，結果顯示獲得雜合子11只，平均雜合子率為47.83%(詳見表1)。

表1 ALK3基因敲除小鼠胚胎冷凍復蘇結果

2.3 體外受精—胚胎移植后的產仔數與正常產仔數比較 ALK3基因敲除小鼠正常配種后生產小鼠數量為4～8只，經體外受精—胚胎移植后的產仔數為3～7只，兩者差異不明顯。

3 小結與討論

胚胎冷凍保存是將動物的早期胚胎，采用特殊保護劑和降溫措施進行冷凍，使其在－196℃的液氮中停止代謝或減弱到足夠小的程度，但又不失去升溫后恢復代謝的能力，從而能長期保存胚胎的一種生物技術。哺乳動物胚胎冷凍保存的研究始于20世紀50年代初期，Smith用甘油作防凍劑，將600枚一細胞兔胚胎冷凍，解凍后培養，僅發育6枚。Whittingham等(1972年)用緩慢冷凍-解凍法冷凍小鼠胚胎獲得成功。Rall等(1985)［8］建立了玻璃化冷凍胚胎的方法，隨后該技術得到了不斷的發展和完善，冷凍程序越來越簡單，解凍后的胚胎存活率越來越高。Kasai等(1990)［9］比較了各種抗凍保護劑對胚胎的化學毒性作用，發現乙酰胺毒性最大，其次為丙二醇、DMSO、丙三醇等，乙二醇毒性最低。由于乙二醇標準分子質量較小，滲透速度快，從而進一步降低了對胚胎的毒性作用。

本實驗的胚胎冷凍方法主要基于ALK3基因敲除小鼠生殖能力低，而體外受精—胚胎移植(IVFET)對該小鼠進行保種傳代的成功率有影響，因此采用傳統的胚胎冷凍方法，冷凍保護劑為DMSO、DAP213。DMSO因其良好的玻璃化性能和滲透能力及低毒性等特點成為首選試劑。

目前，ALK3基因敲除小鼠的冷凍保存雖取得了一定的成功，但移植后妊娠率和子代雜合子還較低，尋求一種適合于轉基因動物的保存技術仍有待進一步研究。通過不斷改進，相信超低溫冷凍保存技術將不僅適用于ALK3基因小鼠胚胎的保存，還將為其他基因敲除動物的保種提供依據。如果與其他胚胎工程技術相結合，還將有利于促進畜牧業和生物工程的進一步發展。

［1］TATEISHIS，NIWAH，MIYAZAKIJ，et al.Enhanced genomic instability and defective postreplication repair in rad18 knockout mouse embryonic stem cells［J］.Mol Cell Biol 2003，23:474－481.

［2］李勁松，成國祥，李厚達.胚胎冷凍技術在轉基因動物中的應用［J］.生物技術，1996，6:1 －4.

［3］Davidson A，Vermesh M，Lobo RA，et al.Mouse embryo culture as quality control for human in vitro fertilization:the one-cea versus the two cell model［J］.Ferfil Stenl，1988，49:516.

［4］唐佐青，譚信，崔允文.不同光照制對小鼠超排卵的影響研究初報［J］.中國優生與遺傳雜志，2003，11(1):70－73.

［5］NakaoK，Nakagata N，Katsuki M:Simple and effcient procedure for cryopreservation of mouse embryos by simple vitrification［J］.Exp.Anim.1997，46:231 －234.

［6］Nakagata N.Studies on Cryopreservation of Embryos and Gametes in Mice［J］.Exp Anim，1995，44(1):1 －8.

［7］陳錫文，管敏強，陳通克，等.ALK3基因敲除小鼠的飼養繁殖及基因型鑒定［J］，黑龍江畜牧獸醫，2009.6:78－79.

［8］Rall WF，Fahy GM.Ice-free cryopreservation of mouse at-196 by vitrification［J］.Nature，1985，313:573 －575.

［9］Kasai M，Komi jH，Takakamo A，et al.A simple method for mouse embryo cryopreservation in a low toxicity vitrification solution，without appreciable loss of viability［J］.J Reprod Fert，1990，89:91 －97.