利用大孢子技術培育黃瓜單倍體的前期研究

盛 慧

（哈爾濱市農業科學院，黑龍江哈爾濱 150070）

培育抗逆性強、抗多種病害、適應性廣、產量高且商品性好的黃瓜新品種是黃瓜育種工作的核心任務[1]。傳統的育種方法費時、費力且效率較低，加之資源匱乏，選育品質好、產量高的新品種就變得更加困難。采用單倍體育種方法進行品種選育彌補了傳統育種的許多不足，成為人們關注的焦點。由于單倍體植株的基因型和表現型完全一致,大大降低了誤選頻率[2]；而且以單倍體為誘變材料,突變隱性基因性狀就可表現出來，獲得突變體的速度可大大加快，從而縮短了育種年限，并可快速產生純合的育種新材料（純系），為提高育種效率提供了可能；還可作為遺傳轉化的優良受體材料。但是，由于單倍體培育受到諸多因素的影響，造成單倍體育種進展緩慢。到目前為止，國內還沒有完整的黃瓜單倍體育種體系，雖然報道較多，但重復性均較差，更沒有見到單倍體育種的后續研究。由此可以說明，單倍體育種在國內仍屬于未攻克的學術難題[3]。本研究利用黃瓜未授粉子房（胚珠）培養，即所謂的大孢子[4]培養技術誘導黃瓜單倍體。經長時間的努力，確定了預培養的必要性和培養基及不同基因型預培養的條件，并確定了胚狀體誘導的高效培養基，誘導率可達92%。文章總結了試驗中遇到的問題及相應的解決方法，為后續的器官分化和生根培養打下一個堅實的基礎[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料：津園5號（華南型）、哈研2186（歐洲溫室型）、均由東北農業大學園藝學院黃瓜分子育種實驗室提供。

1.1.2 試劑：外源調節劑均購自北京益利公司。

2.2 方法

2.2.1 外植體的處理及滅菌：于早上8點到9點之間將次日要開花的子房采摘下來，采摘后立即進行消毒處理。津園5號在消毒前除去掉雌花外還需將刺溜刮去，原因有以下兩點：一是除菌效果不好，即使添加表面活性劑也不易除去刺溜中間的細菌；二是刺溜吸收養分的能力強于胚珠，因此在培養中就會出現由刺溜發育而來的愈傷組織，而胚珠部分因無法吸收到營養而褐化死亡的現象。外植體滅菌過程中氯化汞的使用時間不要超過5min，否則影響預培養的效果。

2.2.2 預培養：預培養對于胚狀體的誘導極為重要。不同基因型在預培養培養基上沒有明顯差異，但在培養條件上差異顯著。津園5號預培養只需將子房塊接種于預培養培養基上，放于室溫下培養即可，光照時間16h/8h，1500~2000lx。哈研2186將子房塊接種在預培養培養基上后，需放置在恒溫培養箱中，35℃暗培養3天[6，7]，而后放于室溫下培養。子房塊的大小對于誘導效果也至關重要，應盡量保持一致，一般1~2mm最佳，過大無胚珠膨大現象，過小子房塊會干癟死亡。預培養培養基為：MS+0.1mg/LTDZ+0.1mg/L NAA，4%Sugar，0.8%Agar。

2.2.3 胚狀體誘導：子房塊在預培養7天后轉接到胚狀體誘導培養基上。誘導培養基中的外源調節劑的種類和計量是一個需要反復摸索的重要因素，尤其是生長素和細胞分裂素的對比情況[8，9]（詳見表1）。經過7~10天的培養，津園5號的胚珠會出現明顯膨大現象，并且周圍的表皮組織白化死亡。繼續培養一段時間后會發現，胚狀體突破珠被向上生長并且始終保持鮮綠狀態。哈研2186經過10~15天的培養后可見胚珠膨大現象，但不如津園5號明顯。繼續培養一段時間后胚狀體突破珠被向上生長，但數量少于津園5號。其中，津園5號胚狀體誘導率可達92%，哈研2186略少（詳見表 2）。

表1 誘導培養基中外源調節劑配比情況

表2 不同外源調節劑對誘導效率的影響

3 結果與分析

3.1 預培養

不進行預培養的子房塊胚珠沒有膨大現象，更沒有胚狀體的形成，可見預培養對于啟動雌核發育起到相當重要的作用。

3.2 胚狀體誘導

對于不同基因型而言，胚狀體的形成時間是有一定差異的。例如，華南型黃瓜胚狀體的形成要早于歐洲溫室型。具體原理還有待于進一步研究。

誘導培養基中生長素/細胞分裂素的比值在胚狀體誘導過程中起著相當重要的作用。隨著比值的減小，胚狀體誘導率逐漸增減，當比值為1時，胚狀體誘導率達到92%。但是有一點必須注意，雖然誘導率提高了，但隨著比值的接近，愈傷組織量也在逐漸增加。經過一段時間培養后，愈傷組織會出現硬化、死亡現象，并且影響胚狀體的進一步生長。說明生長素/細胞分裂素的比值對于胚狀體的繼續生長和器官分化起著關鍵的作用。因此，不能盲目追求高誘導率。試驗中發現6號培養基和1號培養基誘導率雖然只有72%和84%，但是胚狀體的生長速度較其他培養基快，可作為最終的誘導培養基。

3.3 分化培養

待綠胚形成后立刻將種皮去掉，并將胚小心轉接到分化培養基上。分化培養基為MS+0.20 mg/L 6-BA+30 g/L Suc+0.8%Agar，pH 5.8。培養條件為：溫度 22 ℃~25℃，光/暗周期為14 h/10 h。5~7天后便可觀察到有植株形成。不同基因型對分化效率具有一定影響，具體情況見表3。

表3 基因型對分化效率和成苗效率的影響

4 存在的問題及展望

4.1 存在的問題

4.1.1 季節：季節對于單倍體培育有一定影響。總體來說，秋季的誘導率要高于春季，且不易污染，但時間較短。冬季的誘導效果一般，但污染率低，接種后最好放于人工氣候箱中。

4.1.2 基因型：基因型不同誘導效果有差異，但不是造成單倍體培育困難的關鍵因素。同一種培養基可以誘導不同的基因型，只是誘導效率高低不同而已，但差距不會很懸殊。

4.1.3 培養基：歸根結底，導致單倍體培育失敗的原因還是我們沒有找到合適的培養基。基本培養基選擇中，MS要好于N6和White；培養基中外源調節劑的種類及含量直接影響著試驗的成敗。胚狀體在進行器官分化時要適當減少2，4-D的用量。

4.1.4 培養條件：培養條件各文獻報道中沒有明顯差異，均為室溫（25±1）℃，光照 1500~2000 lx。

4.2 展望

單倍體培育對于研究作物遺傳育種起著重要的作用[10~12]。它在新品種培育方面、親本鑒定方面以及分子生物學研究方面意義重大[13，14]。目前，國外在單倍體培育方面已取得了相當大的成績[15]；而國內還處于研究階段，雖屢見報道但重復性較差。單倍體育種工作道路艱難，作為育種工作者還須繼續努力，探討出誘導效率高且重復性較好的培養基，創造利于單倍體生長的優越條件，為單倍體育種的后續研究打下一個堅實的基礎。

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