檉柳類鋅指基因ThZFL酵母誘餌表達載體的構建及其表達驗證1)

鄭唐春 王 英 臧麗娜 王亞軍 曲冠證 夏德安

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業大學)，哈爾濱，150040)(嘉蔭縣林業局)(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業大學))

檉柳(Tamarix hispida)是分布在干旱荒漠區域的一類常見的鹽生、旱生和沙生植物，具有良好的防風固沙作用，通過對其進行干旱、鹽脅迫處理提取RNA進行RT－PCR分析，然后對獲得的檉柳cDNA文庫的測序及Blast比較分析，獲得了一個具有完整開放讀碼框的基因序列(GenBank No.EG971462)，因其與擬南芥的命名為 C2H2型鋅指蛋白(AT5G16470、AT3G02790、TAIR)的基因具有較高的相似性(氨基酸序列相似性約為80%)，并且通過對SwissProt數據庫進行Blast未發現有相似的已知植物蛋白基因，因此可以認為此基因為一個新基因。此基因與來源于哺乳動物的特定鋅指基因(ZFP706，Q9Y5V0)具有一定的相似性(氨基酸相似性22%)，因此暫時命名該基因為ThZFL(Tamarix hispida Zinc finger like gene)［1］。

鹽堿耐受性的應答機制是受多基因表達互作調控的，例如各種各樣的相溶性溶質或滲透劑，多胺類，活性氧分子和抗氧化劑的防衛機制，離子運輸和有害離子的區分［2］。多基因間復雜的相互作用導致的高效脅迫應答系統機制尚不清楚，因此尋找相關蛋白之間的聯系，繪制蛋白質相互作用圖譜就顯得格外重要。由Fields和Song［3］發明的酵母雙雜交系統，實現了在活體細胞內驗證蛋白質間的相互作用。目的蛋白經過在真核細胞中修飾加工后，更能體現其正常的生理活性，對研究此基因的具體生理功能提供實驗依據。

本試驗以檉柳的cDNA文庫為模板，擴增全長的目的片段，構建酵母誘餌表達載體pGBKT7－ThZFL，使其在酵母中穩定表達。檢測其表達蛋白對酵母菌株所含的4種報告基因有無自激活作用及對酵母菌株自身是否有毒害作用，為下一步通過酵母雙雜交方法在檉柳cDNA文庫中篩選與ThZFL蛋白相互作用的蛋白奠定基礎，也為探究ThZFL基因在細胞中的生理功能和表達機制提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

檉柳cDNA由本實驗室保存;E.coli DH5α感受態菌株購自天根生化科技有限公司(北京);酵母雙雜交表達載體pG-BKT7－BD，對照質粒 pGBKT7－53、pGBKT7－lam、pGAD－T，Y2Hgold和Y187酵母菌種，酵母省缺培養基及轉化試劑均購自Clontech公司;質粒提取、膠回收試劑盒購自OMEGA公司(美國);PCR相關試劑、DNA marker、pMD18－T載體、限制性內切酶EcoR I、BamH I，T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司(日本);胰蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、YNB(無氨基酸酵母氮源)購自 Amresco公司(美國)，Yeastmaker Carrier DNA、X－αgal、3－AT等購自Clontech公司(美國);所用引物由英濰捷基貿易有限公司合成(上海);DNA序列由六合華大基因科技股份有限公司測定(北京);其他試劑為進口或國產分析純。

1.2 酵母誘餌載體的構建

1.2.1 引物設計

根據ThZFL基因序列(GenBank No.EG971462)，并結合酵母表達載體pGBKT7－BD讀碼框及多克隆位點自行設計引物，BLAST分析排除異源基因同源性序列，序列設計:上游引物 Primer－F:5'－ATCGAATTCACGATGGCAGGAAAGGCGAAGCC－3'含有編碼區20個核苷酸，其中5'端含有EcoR I酶切位點;下游引物 Primer－R:5'－AGCGGATCCTTAGATCTTCTTGAGGCTTCC－3'含有編碼區21個核苷酸，其中5'端含有BamH I酶切位點。

1.2.2 PCR 克隆目的基因

以檉柳cDNA為模板，進行PCR克隆。反應體系:cDNA 1 μL;10×PCR Buffer 2.5 μL;dNTP(10 mmol/L)2 μL;Primer－F(10 μmmol/L)2 μL;Primer－R(10 μmmol/L)2 μL;rTaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，加 ddH2O 至終體積 25 μL。反應條件:94℃ 4 min、94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 1 min共35個循環，72℃ 7 min。取3 μL反應產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.3 PCR 產物連接 pMD18－T 載體

將PCR產物電泳后，用膠回收試劑盒回收目的條帶，然后與pMD18－T載體進行連接，反應體系:T4 DNA連接酶1 μL;10×T4 DNA 連接酶 buffer 1 μL;PCR 產物 4 μL;pMD18－T載體1 μL，加水至終體積10 μL。室溫過夜重組反應，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布到含有IPTG(24 mg/mL 10 μL)和 X－Gal(20 mg/mL 40 μL)的氨芐青霉素(Amp 50 μg/mL)LB平板上，37℃培養12～16 h，觀察藍白斑菌落。隨機挑取白色菌落，進行菌液PCR再用質粒提取試劑盒提取質粒PCR驗證，驗證完成后取菌液送北京六合華大進行序列測定。

1.2.4 構建酵母誘餌表達載體

對測序正確連有目的基因的pMD18－T載體和pGBKT7－BD空載體，用BamH I和EcoR I限制性內切酶酶切，酶切體系:BamH I 2 μL;EcoR I 2 μL;10×K buffer 3 μL;質粒 15 μL;ddH2O 9 μL。混勻后先在30℃水浴鍋中恒溫處理3～4 h，期間每隔半個小時震蕩1次，然后轉到37℃水浴鍋中繼續恒溫處理3～4 h。酶切完成后用1%瓊脂糖凝膠電泳，用試劑盒膠回收酶切后的目的片段。然后進行目的片段的連接重組，重組體系:T4 DNA連接酶1 μL;10×T4 DNA連接酶buffer 1 μL;目的片段6 μL;pGBKT7－BD 載體2 μL，終體積10 μL。16℃過夜連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，涂布含有卡那霉素(Kana 50 μg/mL)的LB平板培養，37℃恒溫培養16～20 h。然后挑取單克隆進行菌液PCR，提質粒進行質粒PCR和酶切鑒定，最后將陽性克隆送往北京六合華大基因有限公司測序鑒定。

1.2.5 酵母Y2Hgold感受態制備

購買的酵母菌株為Y2Hgold，將凍存于－70℃的Y2Hgold劃線接種于新鮮的YPDA平板倒置于30℃孵育3～4 d，在15 mL的離心管中，加入3 mL的新鮮YPDA液體培養基，挑取2～3 mm的單克隆，震蕩混勻，在30℃，250 r/min中震蕩培養8～12 h;轉移5 μL培養液到50 mL(250 mL的培養瓶)新鮮的YPDA 中，繼續震蕩培養，直至 OD600達到0.15～0.30(約16～20 h);在室溫下，將酵母培養液700 g離心5 min，棄上清，用100 mL的YPDA液體培養基重懸，30℃溫育，使OD600達到0.4～0.5(約3～5 h);將培養液分到兩個50 mL的離心管中，700 g室溫離心5 min，棄上清，各用30 mL的滅菌的去離子水重懸;再700 g 室溫離心5 min，棄上清，各用 1.5 mL 1.1×TE/LiAc重懸;分裝于2個1.5 mL離心管中，高速離心15 s，棄上清，每管用600 μL 1.1×TE/LiAc重懸，至此感受態制備完成。

1.2.6 酵母誘餌載體轉化酵母Y2Hgold及其陽性驗證

酵母Y2Hgold感受態制備完成后，取兩個1.5 mL離心管中分別加入100 ng的pGBKT7－ThZFL載體和pGBKT7－BD空載體，再各加入5 μL(10 mg/mL)的變性的鯡魚精載體DNA，50 μL 的感受態細胞，500 μL 的 PEG/LiAc，輕輕震蕩混勻;在30℃水浴鍋中溫育30 min，每間隔10 min輕輕震蕩1次;然后每個管中加入20 μL的DMSO，混合均勻，放在42℃水浴中15 min，間隔5 min，輕輕震蕩1次;高速離心15 s，棄上清，用1 mL YPD plus液體重懸;繼續高速離心15 s，棄上清，用無菌的1 mL 0.9%NaCl液體重懸。按照1 ∶10，1 ∶100，1 ∶1 000 稀釋后，吸取100 μL，涂布 SD/－Trp平板，30℃倒置培養 3～4 d，觀察轉化情況。隨機挑取直徑大于2 mm的菌落進行陽性驗證。

1.2.7 酵母誘餌載體的自激活作用驗證

隨機挑取直徑大于2 mm的含有pGBKT7－ThZFL質粒及對照空載體pGBKT7－BD單克隆，用20 μL無菌水重懸后，分別畫線于 SD/－Trp/X－α－gal、SD/－Trp/X－α－gal/AbA、SD/－Leu/－Trp/X－α－gal、SD/－Trp/－Leu/－His/X－α－gal培養基平板上，30℃培養3～5 d后觀察平板的生長情況及菌落顏色變化，來檢測誘餌蛋白有無自激活作用。

1.2.8 酵母誘餌載體對酵母自身的毒性檢驗

在經陽性驗證的平板上挑取直徑大于2 mm的單菌落，分別接種與5 mL SD/－Trp(Kana 50 μg/mL)液體培養基中，30℃ 230～250 r/min，震蕩培養12 h，將過夜菌液以1∶100稀釋后接種于100 mL的 SD/－Trp(Kana 50 μg/mL)液體培養基中，在同樣條件下繼續培養，并分別于培養后 0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 h 后吸取菌液3 mL，以新鮮的 SD/－Trp 液體培養基為空白對照，用可見光分光光度計在OD600處測定其吸光度，繪制酵母生長曲線，分析誘餌蛋白對酵母細胞自身有無毒害作用。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增ThZFL基因編碼序列

以檉柳cDNA為模板進PCR擴增，取產物3 μL，在1%的瓊脂糖凝膠電泳，獲得1條亮帶，分子大小介于250～500 bp，與目的基因大小的318 bp相符(圖1)。

2.2 將目的條帶連接到pMD18－T載體

膠回收PCR產物，與pMD18－T載體連接后轉化大腸桿菌，獲得重組質粒pMD18－T－ThZFL，首先對質粒 pMD18－TThZFL進行PCR檢驗，然后用BamH I和EcoR I進行雙酶切驗證，最后送樣到北京六合華大公司測序，測序結果分析表明所擴增的目的片段和基因庫中的ThZFL基因序列(GenBank No.EG971462)完全一致，沒有發生堿基突變。

圖1 ThZFL基因的PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳

2.3 酵母誘餌表達載體的構建及驗證

用 BamH I和 EcoR I對質粒 pMD18－T－ThZFL、酵母空載體pGBKT7－BD同時進行雙酶切后(圖2)，用T4連接酶連接后轉化到大腸桿菌中，獲得重組載體暫命名為pGBKT7－ThZFL，提取質粒PCR驗證(圖3)，雙酶切目的條帶(圖4)，對菌液送樣測序。測序結果表明檉柳ThZFL基因已經完全重組到酵母表達載體中，未發生堿基突變，至此酵母誘餌表達載體構建完成。

圖2 重組質粒pMD18－T－ThZFL和pGBKT7－BD的 BamH I和EcoR I雙酶切鑒定

圖3 誘餌質粒pGBKT7－ThZFL PCR產物電泳

2.4 pGBKT7－ThZFL載體轉化酵母Y2Hgold菌株及陽性驗證

通過TE/LiAc法制備Y2Hgold酵母感受態，用PEG/LiAc法將誘餌載體轉化到酵母細胞中，涂布到SD/－Trp平板上篩選陽性克隆，隨機挑取單菌落PCR，提取質粒PCR，BamH I、EcoR I雙酶切驗證，都在300 bp左右獲得目的條帶，表明pGBKT7－ThZFL質粒已經成功轉化到酵母細胞中(圖5)。

圖4 重組質粒pGBKT7－ThZFL的BamH I和EcoR I雙酶切鑒定

圖5 誘餌表達載體pGBKT7－ThZFL轉化酵母后菌液PCR產物電泳

2.5 誘餌蛋白的自激活驗證

酵母轉化涂板3 d后觀察平板發現，誘餌載體和空載體對照都在 SD/－Trp/X－α－gal上生長，菌落顏色為白色，SD/－Trp/X－α－gal/AbA、SD/－Leu/－Trp/X－α－gal、SD/－Trp/－Leu/－His/X－α－gal平板上都未見菌落生長，說明酵母誘餌表達載體沒有自激活作用(表1)(圖6)。

表1 pGBKT7－ThZFL的自主激活作用的檢測

2.6 誘餌蛋白對自身的毒害作用

從單缺板上挑取的陽性克隆，與空載體的對照菌在SD/－Trp液體培養基中，在30℃中震蕩培養，每隔3 h，吸取培養液測定OD600處的吸光度。數據結果表明，兩者在OD600處的吸光度隨時間先增長后穩定，但兩者生長情況變化不顯著，整體生長曲線相同，說明重組誘餌載體pGBKT7－ThZFL對酵母自身沒有毒害作用(表2)。

圖6 在SD/－Trp/X、SD/－Trp/X/A、DDO/X平板上的自激活驗證

表2 酵母誘餌載體pGBKT7－ThZFL和陰性對照載體pGBKT7－BD的生長對比

3 討論

檉柳(Tamarix hispida)是干旱荒漠區域常見的沙生植物，除具有抗旱能力外，還普遍具耐鹽性。檉柳屬于典型的泌鹽性鹽生植物，泌鹽腺的分泌細胞內含許多小的液泡，通過主動運輸將積累的鹽分儲存在液泡中而實現區隔化，維持細胞液中正常的滲透勢［4］。因此，從檉柳基因庫中尋找抗旱、抗鹽基因，研究植物的脅迫抗性具有重要意義。Wang Yucheng等［5］從檉柳中克隆到一個新的bZIP基因，在轉基因煙草中能增強過氧化酶(POD)和過氧化物歧化酶(SOD)的活動，并增加可溶性糖與可溶性蛋白質的含量。Guo Xiaohong等［6］從檉柳根系鹽脅迫cDNA文庫中，分離出一個編碼冷凍適應蛋白基因ThCAP，轉基因楊樹對低溫具有較強的抵抗能力。最新研究表明，檉柳中的V－ATP酶亞基基因ThVHAc1，編碼由4個跨膜結構域構成的高級疏水蛋白。RT－PCR數據表明NaCl、NaHCO3、PEG和CdCl2脅迫能誘導該基因在檉柳的根、莖、葉中表達，在非脅迫條件下，脫落酸(ABA)的外源性應用也能刺激ThVHAc1的轉錄水平，表明該基因參與ABA－依賴性脅迫信號途徑。另外，ThVHAc1轉酵母菌株能提高對鹽、干旱、紫外線、氧化劑、重金屬、冷凍和高溫耐性［7］。因為檉柳生長于環境惡劣的荒漠地區，在自然選擇的條件下，適應嚴酷條件的抗性基因得到富集與積累，所以從檉柳基因組中探究新基因的生理功能具有重要的經濟價值與生態意義。

植物鋅指基因是一類廣泛研究的抗逆性植物基因蛋白，廣泛分布在動植物和微生物中。大量研究表明，一些鋅指蛋白與植物的抗逆性有關。例如:在胡椒中克隆到一個對氧化物、甲基紫精、過氧化氫和脫落酸等產生脅迫應答反應的新基因(CaAbsi1)，該基因可能在植物創傷和非生物脅迫產生的多基因應答中發揮重要的作用［8］;研究人員還從菊花中分離到一個C2H2鋅指蛋白基因DgZFP，該基因在種子中可被NaCl、干旱、冷凍處理和微弱的ABA誘導，DgZFP的過表達能增強轉基因煙草的耐鹽性［9］;Byung Kook Ham 等［10］還發現鋅指蛋白基因(Tsip1)，在煙草中過表達能提高其對水楊酸、乙烯、酸、鹽和病毒的耐性。最新研究發現，特殊的鋅指基因對植物的生長和發育可能存在著致命的影響，在用CaMV 35S啟動子過量表達編碼鋅指蛋白的AZF1和AZF3基因轉染擬南芥時，轉化效率非常的低，無法獲得任何轉基因植株［11］;Xu Shouming等［12］在研究檉柳的ThZF1基因在非生物脅迫下的功能時，嘗試著在CaMV 35S啟動子下過量表達ThZF1基因轉染野生型擬南芥從而獲得轉基因擬南芥，但一直沒獲得轉基因苗。

酵母雙雜交是一種簡便快速研究蛋白質間相互作用的一種方法。與傳統的方法相比，其最大的優勢在于不用分離純化蛋白質，而是將所研究的基因置于真核酵母細胞體內表達目的蛋白，從而為蛋白的功能修飾提供一個場所。通過酵母雙雜交技術，為研究蛋白質與蛋白質間的相互聯系提供了支持，蛋白關系圖譜變得越來越清晰，通過研究已知蛋白的功能，也能為探究新基因的生理功能提供理論依據。如將檉柳的Thprxl基因構建到酵母誘餌表達載體，通過雙雜交篩選驗證獲得了兩個與ThPrxl蛋白互作的蛋白，分別是油體鈣蛋白(ealciumlipid binding protein)和與 CONSTANS互作蛋白(CONSTANS interacting protein)［13］;以擬南芥的 HHP1 基因作為誘餌，從cDNA library中篩選到編碼ZFHD1(at1g69600)和ICE1(at3g26744)的基因，有趣的是ICE1和ZFHD1都參與冷凍和滲透脅迫的信號網絡［14］;通過微陣列分析，發現水稻籽苗中的鋅指蛋白基因(ZFP179)能誘導OsDREB2A、OsP5CS、OsProT和OsLea3一系列基因表達，共同對NaCl、PEG 6000、ABA等脅迫處理產生應答反應，從而使轉基因水稻能增強抗氧化脅迫能力，活性氧清除能力，轉基因植物還能增加自由脯氨酸和可溶性糖的含量［15］。

前期研究結果證明ThZFL基因受鹽、滲透及冷脅迫等誘導，煙草的轉基因試驗證明ThZFL基因的過量表達能提高煙草的耐鹽、抗滲透等抗逆性，轉基因酵母也表明對低溫、NaCl、甘露醇和LiCl等脅迫有一定的應答反應。為進一步探究ThZFL基因的生理功能，構建了酵母誘餌表達載體，通過酵母雙雜交技術從檉柳cDNA文庫中篩選與之相互作用的蛋白和基因，參考對已知功能蛋白的研究，來推測并驗證該基因的生理功能及抗性機理。本實驗通過cDNA PCR、雙酶切、基因重組、DNA測序等技術，成功將ThZFL基因構建到酵母誘餌表達載體獲得轉化子pGBKT7－ThZFL，并成功轉化進入酵母菌種Y2Hgold(含有真菌抗生素AbA(AnreobasidinA))，通過在SD/－Trp平板上篩選陽性克隆及單克隆培養在液體SD/－Trp(Kana 50 μg/mL)培養基中獲得的生長曲線，證明pGBKT7－ThZFL酵母載體對酵母自身沒有毒性作用。通過SD/－Trp、SD/－Trp/X、SD/－Trp/X/A、DDO、TDO 平板篩選，試驗結果顯示轉化了誘餌載體的Y2Hgold酵母在SD/－Trp板上生長，SD/－Trp/X板上生長但不變藍，SD/－Trp/X/A板上不生長，DDO、TDO平板上不生長，證明誘餌蛋白沒有自激活功能，不能激活報告基因的表達。許多研究表明，鋅指蛋白具有核定位特征，并在酵母誘餌表達載體中具有自激活功能［16］，研究表明，此基因既不具有核定位特征，也不能激活酵母雙雜交系統中報告基因的表達，盡管ThZFL基因的同源基因在擬南芥中被標注為鋅指基因，但實際上ThZFL基因完全不屬于鋅指蛋白基因家族，而是一個新基因［1］。以上數據為應用酵母雙雜交技術篩選與誘餌蛋白相互作用的靶蛋白奠定了實驗基礎，有助于進一步探究ThZFL基因的生理功能和抗逆機理。

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