米諾環素調控小膠質細胞激活對PC12細胞生長的影響

鐘健強 郭建軍 盧 奎 沈慶煜，

1.廣東省增城市人民醫院神經科，廣東增城 511300；2.中山大學附屬第二醫院神經科，廣東廣州510120

隨著我國人口老齡化趨勢的到來，帕金森病這一常見老年神經退行性疾病越來越受到研究者重視。近年來，眾多研究報道小膠質細胞（microglia，MG）的激活參與中樞黑質紋狀體炎癥過程，從而加重帕金森病多巴胺能神經元的變性凋亡過程[1]。通過調控小膠質細胞激活狀態而控制其后續的炎癥反應成為近年來神經系統退行性疾病的研究熱點。小膠質細胞在中樞組織中顯示出強大的固有免疫功能，但其后續無控制的神經炎癥在很多神經退行性疾病的損傷機制中起著推動作用。同樣，MG的激活在帕金森氏病的神經元損傷中也存在類似的毒性效應，從而加重黑質紋狀體通路多巴胺神經元變性。米諾環素（minocycline）屬于四環素家族的廣譜、二代半合成脂溶性抗生素。研究報道，米諾環素能有效抑制LPS刺激的MG激活，從而下調炎癥因子TNF-α、IL-1β和NO的表達[2]。筆者設想，米諾環素能通過抑制MG激活引發的炎癥反應從而減輕對多巴胺能神經元的損傷。PC12細胞的生物學特性類似于多巴胺能神經元，常作為帕金森病的離體研究模型。本實驗擬通過米諾環素對LPS刺激后的小膠質細胞株BV2激活進行干預，進而觀察干預BV2細胞對PC12細胞生長、增殖的影響，探討米諾環素在MG對PC12細胞生長影響中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑耗材

細胞培養所需的DMEM-F12培養基、胎牛血清、雙抗、胰酶均購于GIBICO公司。LPS（L2880）、米諾環素（M9511）、二甲基亞砜（DMSO）購于美國Sigma公司；酶聯免疫吸附法（ELISA）預包被試劑盒小鼠源TNF-α、IL-1檢測試劑盒購于深圳達科為生物公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）購于MBchem公司。6、96孔transwell共培養板購于corning公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養、分組和共培養 多巴胺能神經元細胞系PC12以及小膠質細胞系BV2均購于中國醫學科學院基礎所細胞中心。PC12細胞、BV2細胞的培養基均為含10%胎牛血清（FBS）的DMEM-F12培養基，培養基均已加入雙抗（靑、鏈霉素），細胞置于5% CO2，37℃的細胞溫箱培養。兩種細胞均為貼壁生長，3～5 d傳代1次。將BV2細胞接種于6孔（2×105cells/孔）、24孔（1×104cells/孔）和 96孔 transwell（5×103cells/孔）共培養板的上層板中，按如下因素進行BV2細胞分組：CON組，LPS組，LPS+MINO組。CON組：BV2細胞不加任何干預因素作為對照組；LPS組：BV2細胞培養液內加入LPS至終濃度為3 ng/mL，刺激約30 min后換掉含有LPS的培養液，清洗3遍；LPS+MINO組：BV2細胞培養液內加入LPS（同上組），在加LPS的同時加入米諾環素（終濃度至60 μmol/L）。將PC12細胞分別接種于6孔和96孔Transwell共培養板的下層板中，接種密度與對應BV2細胞相同，上下層板之間為半透膜，允許水分和中等大小的蛋白自由通過，使上下層細胞實現共培養。共培養24 h后，取各組上清液及下層板的PC12細胞做下一步實驗。

1.2.2 ELISA法 檢 測 TNF-α、IL-1β 表 達 6孔 Transwell共培養板中，實驗各組分別設置3個復孔，分別提取各組上層板BV2細胞的上清液，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定TNF-α、IL-1β的濃度。步驟嚴格按照廠商提供的說明書操作，最后在595 nm波長讀取OD值，輸入標準蛋白濃度，繪制標準曲線，計算出TNF-α、IL-1β的濃度。

1.2.3 四甲基偶氮唑鹽法（MTT）檢測PC12細胞存活率 各組生長有PC12細胞的96孔板下板，予200 μL/孔更換培養液，每組設6個復孔，并設與試驗孔平行的本底對照孔，比色時以本底對照孔調零。每孔加入20 μL MTT至終濃度濃度0.5 mg/mL，在37℃培養箱內孵育4 h，棄培養液，加入150 μL DMSO，振蕩儀振蕩10 min，至紫色晶體顆粒充分溶解，酶標儀檢測595 nm的OD值。細胞存活率=加藥組A值/溶劑對照組A值×100%，并以6個復孔的平均值作為單個數據計算存活率。

1.3 統計學處理

實驗數據資料應用SPSS17.0統計軟件作統計學分析，計量資料用（± s）表示，多組資料間的比較采用單因素方差分析，處理組間的兩兩比較采用LSD-t檢驗，P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 共培養體系各組炎性因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）表達水平

通過ELISA實驗測定共培養體系的炎癥因子TNF-α和IL-1β表達水平見圖1。共培養24 h后，LPS刺激MG后細胞外釋放的TNF-α和IL-1β明顯升高，在米諾環素干預后有所降低。與CON組比較，*P ＜0.01；與LPS組比較，#P ＜ 0.01。

圖1 各組共培養液TNF-α、IL-1β表達量示意圖

2.2 共培養體系各組PC12細胞存活率比較

對各組MTT檢測結果進行單因素方差分析，各組間細胞存活率差異有統計學意義（F=58.64，P ＜0.01）。LPS組細胞存活率（43.58±1.87）%低于CON組（P ＜0.01）；LPS組細胞存活率（71.13±2.52）%高于LPS組（P ＜0.01）。見表1。

表1 MTT法檢測各組細胞存活率（x ± s）

3 討論

帕金森病是常見的老年中樞神經變性疾病，其病理改變為中腦黑質致密部多巴胺能神經元進行性變性丟失，紋狀體區多巴胺水平下降，剩余的多巴胺能神經元內形成以α-突觸共核蛋白（α-syn）為主的嗜酸性包涵體-路易氏小體（LB）[3]。近年來，很多研究表明免疫/炎性機制參與到帕金森病的發病機制中。Orr等[4]發現中樞黑質存在小膠質細胞的激活以及炎癥因子的表達，由此推斷帕金森病的發生發展可能與小膠質細胞過度激活引發的炎癥反應有關。MG激活還能通過氧化應激促進多巴胺能神經元變性凋亡[5]。MG在腦組織中顯示出強大的固有免疫功能，但其在免疫應答中釋放出來的炎性因子嚴重的影響了神經元的活動及其信息處理能力[6]。

帕金森病傳統的治療方式大多為恢復中樞多巴胺遞質水平，但亦不能阻止多巴胺能神經元的持續變性損害。抑制MG激活進而下調其黑質區后續的炎癥反應成為治療PD的一條新思路。米諾環素是第2代四環素類抗生素，并且是一種潛在的腦損傷神經保護劑，它很好的通過血腦屏障達到臨床有效治療濃度。米諾環素可以抑制γ-干擾素誘導的蛋白激酶磷酸化，進而抑制干擾素調節因子-1（IRF-1）基因易位而導致的Ⅱ類抗原反式激活因子（CIITA）增高，下調MHC-II導致靜息狀態MG的抗原呈遞減少，最終降低MG的激活程度[7]。Filipovic等[8]研究表明米諾環素可以減少MG激活所致的神經元損傷以及降低BCL-2家族蛋白丟失轉移所致的細胞凋亡率。但是，米諾環素能否用于調控黑質區域MG激活，更進一步抑制多巴胺能神經元變性凋亡呢？米諾環素能通過對抗線粒體功能抑制MPP+誘導的PC12細胞凋亡[9]，這說明米諾環素對PC12細胞的有著直接的保護效應，但是否通過MG介導PC12細胞損傷，尚未見文獻報道。本實驗采納BV2與PC12共培養體系模擬體內MG和多巴胺能神經元的相互作用，并用經典的LPS刺激MG激活。共培養后，上清液中檢測到TNF-α、IL-1β較未刺激的對照組明顯升高。既往研究證實，TNF-α基因沉默小鼠可一定程度對抗MPTP毒性，說明TNF-α可協同MPTP對中樞多巴胺能神經元的毒性[10]。眾多研究表明，IL-1β在帕金森病發生進展中發揮重要作用[11]。運用米諾環素抑制MG激活后，觀察到后續的炎癥介質TNF-α、IL-1β表達下降。炎癥表達的下調直接降低了PC12細胞的凋亡，增加了其存活率，這證實了米諾環素可能通過抑制MG激活而下調TNF-α、IL-1β等炎癥因子表達，從而保護PC12細胞，降低凋亡的發生率，促進中樞多巴胺/乙酰膽堿遞質平衡。

綜上所述，米諾環素抑制MG激活可下調其炎癥表達，該效應可降低PC12細胞的凋亡發生，并提高其存活率，這對PD患者的治療來說無疑是一種可嘗試的新途徑。但是，MG的激活是由多種外界因素以及內環境所導致的，調控PD的MG激活是否發揮主要治療作用，是否存在更多的聯合干預機制，這有待進一步研究證實。

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