黃芪總皂苷提取方法的優(yōu)化

高 山，郭愛(ài)華

(山西職工醫(yī)學(xué)院，山西太原 030012)

黃芪是植物膜莢黃芪(Astragal us membranaceusB-ge)和蒙古黃芪(Astragal us membranaceusBge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao)的根[1]，為重要的補(bǔ)氣藥。而渾源黃芪 (hunyuanRadix Ast ragali)素有“天下黃芪之宗”的說(shuō)法，其原植物以蒙古黃芪為主，主要含有皂苷類、黃酮類、多糖類以及氨基酸類等成分[2]。藥理實(shí)驗(yàn)表明:黃芪總皂苷具有顯著抑制血小板聚集和抗血栓形成的作用[3];黃芪皂苷可以促進(jìn)淋巴增殖和抗體的增加，加強(qiáng)體液的細(xì)胞免疫應(yīng)答[4];黃芪甲苷能夠抑制組胺引起的腦微血管通透性增加[5]，可以清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、增強(qiáng)免疫力、抗病毒以及促進(jìn)細(xì)胞增殖等[6]。本研究以黃芪甲苷為標(biāo)準(zhǔn)，采用比色法，對(duì)渾源黃芪中皂苷類化學(xué)成分提取工藝進(jìn)行了探討，為渾源黃芪等級(jí)的合理劃分提供依據(jù)，從而為黃芪的種植、采收、加工、開發(fā)等提供科學(xué)數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)，以便于充分利用有限的藥材資源和地質(zhì)資源，提高黃芪基地的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

1 材料與儀器

1.1 材料

渾源黃芪(由山西省渾源縣黃芪基地提供)，山西醫(yī)科大學(xué)天然藥物教研室楊官娥教授鑒定為蒙古黃芪;黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品(由中國(guó)生物制品檢定所提供，批號(hào)為110781-200613);所用水均為蒸餾水;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

756MC型紫外分光光度儀(上海分析儀器總廠);FA1104型萬(wàn)分之一電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司天平儀器廠制造);202 V1型電熱恒溫干燥箱(上海試驗(yàn)儀器廠有限公司);KQ-100型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);DZKW電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠);RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)。

2 結(jié)果

2.1 含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.1.1 線性關(guān)系考察

精密稱取黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品5.500 mg，定容于10mL容量瓶中，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL(分別標(biāo)記為 1、2、3、4、5、6)于具塞試管中，80℃ 水浴揮干，分別加入0.2mL5%香草醛冰醋酸溶液和0.8mL高氯酸溶液，70℃水浴20min，流水冷卻，加入5mL冰醋酸，于560 nm處比色，測(cè)吸光度A。以A為縱坐標(biāo)y，溶質(zhì)量為橫坐標(biāo) x，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，溶質(zhì)量在0.110～0.385 mg范圍內(nèi)線性良好。回歸方程為y=0.037 6+5.008 8x，r=0.999 7。線性關(guān)系見圖 1。

圖1 黃芪甲苷Fig 1 Astragaloside

2.1.2 精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取對(duì)照品溶液0.5mL于具塞試管中，按線性關(guān)系考察項(xiàng)下自“80℃水浴揮干”起，至“加入5mL冰醋酸”操作，然后于560 nm處重復(fù)測(cè)定5次，測(cè)定吸光度平均值1.408，RSD為0.78%，結(jié)果表明儀器精密度良好。見表1。

表1 精密度測(cè)定結(jié)果Table 1 Precision

2.1.3 回收率實(shí)驗(yàn)

采用加樣回收法，取已知總皂苷含量樣品5份，精密稱取各約3 g，分別精密加入黃芪甲苷對(duì)照品約1 mg，按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液 ，精密量取0.1mL于具塞試管中，按線性關(guān)系考察項(xiàng)下自“80℃水浴揮干”起至“于560 nm處比色”操作，計(jì)算平均回收率為95%，RSD為1.28%。見表2。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 mg Table 2 Rate of Recovery

2.2 樣品提取方法考察

稱取黃芪粗粉3份，每份3 g，用15倍75%乙醇浸泡過(guò)夜(19:00時(shí)至次日10:00時(shí))，超聲40min，過(guò)濾。稱取黃芪粗粉3份，每份6 g，用15倍75%乙醇浸泡過(guò)夜(19:00時(shí)至次日10:00時(shí))，回流提取60min，過(guò)濾。

將上述所得濾液水浴蒸干，分別進(jìn)行如下操作:蒸餾水轉(zhuǎn)移，再用水飽和正丁醇萃取3次(10mL/次)，合并萃取液，用氨試液(40mL氨液加水至100mL)洗滌2次(10mL/次)，棄去氨水層，正丁醇層用蒸餾水洗滌2次(10mL/次)，棄去水層。正丁醇層60℃減壓濃縮至干，甲醇轉(zhuǎn)移至容量瓶中，分別定容至25mL(回流)或10mL(超聲)。

取上述定容液(每種均取0.1mL、0.2mL)于具塞試管中，80℃水浴揮干，分別加入0.2mL5%香草醛冰醋酸溶液和0.8mL高氯酸溶液，70℃水浴20min，流水冷卻，加入5mL冰醋酸，于560 nm處比色，測(cè)A。計(jì)算數(shù)據(jù)見表3。

表3 超聲與回流結(jié)果對(duì)比Table 3 Comparison of Results of Ultrasound and Reflux

從表3數(shù)據(jù)可看出，回流提取雖然時(shí)間較長(zhǎng)，效果與超聲提取效果并無(wú)明顯差異。而超聲相比之下具有操作簡(jiǎn)單、低溫對(duì)成分破壞較小、提取時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，因此提取方法選擇超聲提取。

2.3 正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化超聲提取

選擇溶劑用量、提取時(shí)間、溶劑濃度三因素，分別取三水平，選用L9(33)因素水平表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，各因素水平見表4。

精密稱取9份黃芪樣品各約3 g，按照正交表的9種組合條件進(jìn)行提取(設(shè)計(jì)見表4)，濾液水浴蒸干，分別進(jìn)行如下操作:用10mL蒸餾水轉(zhuǎn)移，再用水飽和正丁醇萃取3次(10mL/次)，合并萃取液，用氨試液(40mL氨液加水至100mL)洗滌2次(10mL/次)，棄去氨水層，正丁醇層用蒸餾水洗滌2次(10mL/次)，棄去水層。正丁醇層60℃減壓濃縮至干，甲醇轉(zhuǎn)移至容量瓶中，分別定容至10mL。取定容液0.1mL于具塞試管中，80℃水浴揮干，分別加入0.2mL5%香草醛冰醋酸溶液和0.8mL高氯酸溶液，70℃水浴20min，流水冷卻，加入5mL冰醋酸，于560 nm處比色，測(cè)A。計(jì)算各工藝皂苷類含量見表5，方差分析見表6。A為溶劑量(倍)，B為提取時(shí)間(min)，C為乙醇濃度(%)。

表4 正交試驗(yàn)因素水平表L9(33)Table 4 Level Chart of Factors of Orthogonal Test L9(33)

表5 回流法正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 5 Test Design of Orthogonal Method foRReflux and Data Statistics

表6 黃芪總皂苷方差分析表Table 6 Analysis Chart foRAstragaloside Variance

2.4 結(jié)果

由表6的方差分析可知，各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響順序?yàn)镃＞A＞B，其中乙醇濃度對(duì)黃芪甲苷的提取有顯著性的影響(P＜0.05)，乙醇用量的影響不顯著(P＞0.05)，提取時(shí)間的影響不顯著(P＞0.05)，綜合考慮，既要保證皂苷類成分的提取，又要兼顧實(shí)際應(yīng)用中的節(jié)能降耗，確定提取工藝條件可選方案 A2B3C1，即溶劑用量15倍，提取時(shí)間40min，乙醇濃度為70%，是最優(yōu)提取工藝。

3 討論

影響中藥材提取的因素非常多，如提取方法、溶劑極性、溶劑濃度、溶劑用量、提取時(shí)間、藥材粒度、浸泡時(shí)間等，本研究?jī)H對(duì)提取方法、溶劑用量、提取時(shí)間、溶劑濃度四個(gè)因素進(jìn)行分析，其余因素均采用同一水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)其他條件一致時(shí)，乙醇的濃度為70%，溶劑用量15倍，提取時(shí)間40min，既可以保證黃芪皂苷的提取，又可以有效地節(jié)約資源，為合理的提取工藝。

目前藥典中黃芪皂苷的質(zhì)量控制以黃芪甲苷為評(píng)價(jià)指標(biāo)，因此，本文以黃芪甲苷為指標(biāo)進(jìn)行含量測(cè)定，優(yōu)選提取工藝是合理的。本文采用比色法進(jìn)行含量測(cè)定，具有易操作、簡(jiǎn)便、成本低、易推廣的優(yōu)點(diǎn)。

[1] 中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

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