前房相關(guān)免疫偏離中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化

張敏敏，張曉敏，趙少貞

（天津醫(yī)科大學(xué)眼科中心屈光角膜科，天津300384）

前房相關(guān)免疫偏離（anterior chamber-associated immune deviation,ACAID）是指在前房種植抗原后所激發(fā)的一種獨(dú)特的偏離式免疫反應(yīng)，表現(xiàn)為（1）抗原特異性介導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)（deleyed-type hypersensitivity,DTH）的T細(xì)胞和分泌補(bǔ)體固定性抗體反應(yīng)的抑制；（2）保留了細(xì)胞毒T細(xì)胞和分泌非補(bǔ)體固定性抗體的B細(xì)胞反應(yīng)；（3）還產(chǎn)生了抑制DTH誘導(dǎo)和表達(dá)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[1]。這一機(jī)制對(duì)防止眼球受到炎癥反應(yīng)的損害和維持眼內(nèi)免疫赦免微環(huán)境非常重要。Foxp3是轉(zhuǎn)錄因子叉頭樣/翼狀螺旋家族(forkhead/winged-helix)的成員[2]，其編碼基因位于X染色體。實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)oxp3分子是賦予調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制功能的主要分子，也是在嚙齒類和人類CD4+和CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞群的標(biāo)志性特征。Foxp3的異位表達(dá)可以將抑制活性轉(zhuǎn)移給某些非調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[3]。CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞，CD8+Foxp3+T細(xì)胞都是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，在其他免疫反應(yīng)中均有明顯的抑制調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)旨在研究CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞、CD8+Foxp3+T細(xì)胞在ACAID形成機(jī)制中的變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及動(dòng)物 C57BL/6小鼠（SPF級(jí)）30只，雌性，體重18~20 g，6~8周齡，購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部[SCXK（京）2006-0008]，飼養(yǎng)在天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。卵白蛋白（OVA）和完全弗氏佐劑（complete Freund’s adjuvant,CFA）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。FITC標(biāo)記的抗小鼠CD3，PE標(biāo)記的抗小鼠CD4，PE-Cy7標(biāo)記的抗小鼠CD25，PE標(biāo)記的抗小鼠CD8a，APC標(biāo)記的Foxp3和大鼠IgG1，破膜透化液均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。小鼠淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自灝洋生物公司。流式分析儀三通閥及螺口注射器購(gòu)自美國(guó)BD公司。工程游標(biāo)卡尺購(gòu)自桂林廣陸數(shù)字測(cè)控股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 ACAID的常規(guī)誘導(dǎo)[4]將小鼠隨機(jī)分為3組，ACAID組、陽(yáng)性對(duì)照組和正常對(duì)照組，每組各10只。ACAID組采用水合氯醛腹腔注射法麻醉小鼠，然后在手術(shù)顯微鏡下，用微量注射器于右眼顳上象限角鞏膜緣內(nèi)1 mm前房穿刺，抽取房水（2 μL），再循原孔接種2 μL OVA溶液（50 mg/mL）。陽(yáng)性對(duì)照組和正常組原孔接種2 μL無(wú)菌PBS溶液。ACAID組和陽(yáng)性對(duì)照組于7 d后將100 μL 2.5%OVA溶液與等體積CFA充分混合乳化，總體積為0.2 mL，皮下注射于小鼠右后足墊內(nèi)免疫動(dòng)物。14 d后用工程游標(biāo)卡尺（精確度為0.01 mm）測(cè)量3組雙耳廓厚度，然后于小鼠左耳廓皮內(nèi)注射20 μL無(wú)菌PBS溶液，右耳廓皮內(nèi)注射20 μL OVA溶液(20 mg/mL)。24 h后，再用工程游標(biāo)卡尺測(cè)量3組雙耳廓厚度，按照下述公式計(jì)算耳廓腫脹數(shù)值。遲發(fā)型超敏反應(yīng)耳廓腫脹數(shù)值=（24 h右耳廓厚度值-0 h右耳廓厚度值）-（24 h左耳廓厚度值-0 h左耳廓厚度值）（μm）

1.2.2 流式檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞和CD8+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量[5]在ACAID組前房注射抗原后第15天，對(duì)各組小鼠斷髓處死，無(wú)菌取出脾臟，加淋巴細(xì)胞分離液密度梯度分離法分離淋巴細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，取1×106/100 μL細(xì)胞加入FITC標(biāo)記抗小鼠CD3抗體，PE標(biāo)記抗小鼠CD4抗體，PECy7標(biāo)記抗小鼠CD25抗體于4℃反應(yīng)30 min，洗細(xì)胞，加破膜透化液固定和破膜，4℃反應(yīng)1 h。加入APC標(biāo)記抗小鼠Foxp3抗體4℃反應(yīng)30 min，洗細(xì)胞重懸后上機(jī)進(jìn)行流式檢測(cè)。APC標(biāo)記大鼠IgG1作為同型對(duì)照。另備1×106/100 μL細(xì)胞加入FITC標(biāo)記抗小鼠CD3抗體和PE標(biāo)記抗小鼠CD8抗體和APC標(biāo)記Foxp3抗體及同型對(duì)照，反應(yīng)步驟同上。分別用CD3+CD4+，CD3+CD8+設(shè)門，分析CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的比例，CD8+Foxp3+T細(xì)胞在CD8+T細(xì)胞中的比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS13.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析，應(yīng)用方差分析檢驗(yàn)3組小鼠耳廓腫脹值、CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞的比例、CD8+Foxp3+T細(xì)胞在CD8+T細(xì)胞的比例的差異，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DTH測(cè)量結(jié)果 前房注射OVA抗原的小鼠耳廓腫脹程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于陽(yáng)性對(duì)照組（表1），說(shuō)明ACAID形成。

表1 OVA誘導(dǎo)的小鼠耳廓腫脹反應(yīng)數(shù)值Tab 1 Ear swelling measurement induced by OVA

2.2 CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量 在ACAID組，小鼠脾臟中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞總量的8.18%，和陽(yáng)性對(duì)照組及正常對(duì)照組相比均有顯著性差異（P<0.05），見圖1。

2.3 CD8+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量 ACAID組小鼠的CD8+Foxp3+T細(xì)胞占CD8+T細(xì)胞的2.12%，和陽(yáng)性對(duì)照組及正常對(duì)照組相比均有顯著性差異（P<0.05），見圖2。

圖1 CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中的比例（*P<0.05）Fig 1 The percentage of CD4+CD25+Foxp3+T cell in CD4+T cell

圖2 CD8+Foxp3+T細(xì)胞在CD8+T細(xì)胞中的比例（*P<0.05）Fig 2The percentage of CD8+Foxp3+T cell in CD8+T cel（l*P<0.05）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采取的是OVA可溶性抗原進(jìn)行ACAID模型的制備，可引起ACAID反應(yīng)的抗原有可溶性抗原[小牛血清白蛋白（BSA）、OVA、視網(wǎng)膜S抗原、光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白（IRBP）]、半抗原、病毒編碼的抗原（單純皰疹病毒）和細(xì)胞表面分子（組織相容性抗原、特殊腫瘤抗原），而無(wú)活性的顆粒性抗原不能誘導(dǎo)ACAID[6]。DTH結(jié)果顯示，本研究前房相關(guān)免疫偏離模型制作是成功的，為接下來(lái)準(zhǔn)確測(cè)定調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化提供了基礎(chǔ)。

為了排除前房注射引起的影響，筆者對(duì)陽(yáng)性對(duì)照組和正常對(duì)照組予前房注射PBS。結(jié)果顯示ACAID組和陽(yáng)性對(duì)照組及正常對(duì)照組相比在CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞和CD8+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量之間均有顯著差異，而陽(yáng)性對(duì)照組和正常對(duì)照組之間在CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞和CD8+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量之間沒有區(qū)別。結(jié)果提示，ACAID中Foxp3的表達(dá)增加是其本質(zhì)特征，并不是由于前房注射引起的并發(fā)結(jié)果。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)外周免疫耐受的誘導(dǎo)和維持起到很重要的作用。而Foxp3是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特征標(biāo)志[7]。Keino等[8]研究顯示了在ACAID中Foxp3在CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明ACAID脾細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的比例較陽(yáng)性對(duì)照組和正常組升高。有研究認(rèn)為，CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞不是直接抑制DTH反應(yīng)，而是對(duì)ACAID的信號(hào)傳入階段起抑制作用。但是其在ACAID中的確切機(jī)制還不清楚，需要進(jìn)一步探索。然而ACAID的誘導(dǎo)不依賴天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，天然CD4+CD25+T細(xì)胞是在正常小鼠胸腺自發(fā)產(chǎn)生的，ACAID產(chǎn)生的調(diào)節(jié)性傳入性T細(xì)胞與天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞有許多相似性，因?yàn)樗鼈兌急磉_(dá)CD4。ACAID調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，尤其是CD4+傳入性T細(xì)胞，可以從CD25-的T細(xì)胞前體轉(zhuǎn)化來(lái)。有實(shí)驗(yàn)顯示，CD4+CD25-的T細(xì)胞，能夠穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，并伴隨Foxp3表達(dá)；在體外，T細(xì)胞與經(jīng)OVA和TGF-β2處理過(guò)的APC共培養(yǎng)后也表達(dá)CD25。因此，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上CD25+的表達(dá)，與天然CD4+CD25+T細(xì)胞在功能上和來(lái)源上都沒有聯(lián)系，體內(nèi)ACAID的誘導(dǎo)，不依賴天然CD4+CD25+細(xì)胞的存在[8]。

在本研究中，筆者證明了ACAID中脾臟CD8+T細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)增加。已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)證明，CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在ACAID的抑制DTH表達(dá)過(guò)程是很重要的[9]。然而，這類細(xì)胞群亞型還不太明確。為了進(jìn)一步研究這種細(xì)胞群，本實(shí)驗(yàn)研究了CD8+T細(xì)胞在脾臟細(xì)胞中的比例。Mc Kenna等[10]發(fā)現(xiàn)前房注入可溶性抗原能夠誘導(dǎo)抗原特異性CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)增。進(jìn)一步的研究，用過(guò)繼轉(zhuǎn)移的方法揭示出這群細(xì)胞的抑制活性。結(jié)果顯示ACAID小鼠脾臟中的CD8+T細(xì)胞能夠抑制已接觸抗原的T細(xì)胞介導(dǎo)的耳廓遲發(fā)型超敏反應(yīng)。說(shuō)明ACAID小鼠脾臟中CD8+T細(xì)胞中存在傳出性抑制細(xì)胞。另有實(shí)驗(yàn)研究ACAID中CD8+T細(xì)胞Foxp3在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)，結(jié)果顯示當(dāng)細(xì)胞多克隆刺激后CD8+T細(xì)胞的Foxp3的表達(dá)無(wú)論在mRNA水平和蛋白水平都上調(diào)了[11]。提示在ACAID小鼠體內(nèi)存在CD8+Foxp3+T細(xì)胞群。而我們的實(shí)驗(yàn)證明，在ACAID中CD8+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量增加，很可能就是這一類ACAID中具有抑制DTH作用的CD8+T細(xì)胞，而Foxp3的表達(dá)可能是CD8+傳出性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特性。

CD8+T細(xì)胞上Foxp3的表達(dá)也在另外一個(gè)免疫耐受模型（狼瘡小鼠）中研究過(guò)[12]，Hahn等把人工合成的多肽靜脈注射進(jìn)這些小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)CD8+T細(xì)胞上有Foxp3的表達(dá)。這些研究成果都證明了CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞上Foxp3表達(dá)的增加可能在經(jīng)前房或者經(jīng)靜脈的免疫耐受表達(dá)中扮演了非常重要的作用。然而，其在ACAID中的確切作用還有待進(jìn)一步探索。

綜上所述，我們認(rèn)為至少有兩種不同功能的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在ACAID的發(fā)展中起作用。他們可能分別在ACAID的不同階段發(fā)揮了作用，進(jìn)而抑制DTH。雖然ACAID的研究目前取得了一定的進(jìn)展，但要從根本上理順和解釋ACAID的發(fā)生機(jī)制，還需要進(jìn)行大量的深入研究。

［1］孟寧.眼免疫赦免與免疫偏離[J].眼科新進(jìn)展，2000，20(2):161

［2］Lal G,Zhang N,van der Touw W,et al.Epigenetic regulation of Foxp3 expression in regulatory T cells by DNA methylation[J].Nat Rev Immunol,2009,9(2):83

［3］Hori S,Nomura T,Sakaguchi S,et al.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3[J].Science,2003,2999（5609）:1057

［4］Streilein JW,Neiderkorn JY,Shadduck JA.Systemic immune unresponsiveness induced in adult mice by anerior chamber presentation of minorhistocompatibility antigens[J].J Exp Med,1980,152（4）:1121

［5］Lei F,Zhang J,Zang J,et al.A penetrating ocular injury can affect the induction of anterior chamber-associated immune deviation[J].Mol Vis,2008,14（19）:327

［6］翟長(zhǎng)斌.前方相關(guān)性免疫偏離與眼病[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)眼科學(xué)分冊(cè),1998,22(6):364

［7］Daniel RS,Janet C,Sharmila M,et al.The role of ACAID and CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells on CTL function against MHC alloantigens[J].Mol Vis，2008，14（19）:2435

［8］Keino H,Takeucbi M,Kezuka T，et al.Induction of eye-derived tolerance does not depend on naturally occurring CD4+CD25+T regulatory cells[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2006,47（3）:1047

［9］Jiang L,Yang P,He H,et al.Increased expression of Foxp3 in splenic CD8+T cells from mice with anterior chamber-associated immune deviation[J].Mol Vis,2007,13（18）:968

［10］Mc Kenna KC,Xu Y,Kapp JA,et al.Injection of soluble antigen into the anterior chamber of the eye induces expansion and functional unresponsiveness of antigen-specific CD8+T cells[J].J Im munol,2002,169（10）:5630

［11］Fontenot JD,Gavin MA,Rudensky AY,et al.Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells[J].Nat Immunol,2003,4（4）:330

［12］Hahn BH,Singh RP,La Cava A,et al.Tolerogenic treatment of lupus mice with consensus peptide induces Foxp3-expressing,apoptosis-resistant，TGF beta-secreting CD8+T cell suppressors[J].J Immunol,2005,175（11）:7728