小檗堿對糖尿病大鼠血管平滑肌細胞增殖影響研究＊

楊靜 羅岷 劉萍 方飛 劉昌權3△

（1.宜賓衛生學校藥學教研室，四川 宜賓644000；2.宜賓衛生學校生理教研室，四川 宜賓644000；3.宜賓衛生學校內科教研室，四川 宜賓644000）

糖尿病慢性血管病變一直是患者早死及致殘的首要原因，糖尿病患者心血管病的發生率也顯著高于非糖尿病人群。血管平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cells，VSMC）的異常增殖遷移和表型改變是糖尿病慢性血管病變的主要病理學基礎，而血管平滑肌的異常增殖可能與核因子－κB激活有關。小檗堿（Berberine）毛茛科植物黃連素根莖中所含的一種主要生物堿，可由黃連、黃柏或三顆針提取，也可人工合成一種抗菌性生物堿，療效較確切。近年來大量動物實驗研究發現小檗堿具有顯著的降血糖影響［2］，在血管平滑肌細胞增殖方面也能產生抑制作用［3］。因此，本實驗通過培養和建立糖尿病大鼠VSMC模型，觀察小檗堿對大鼠VSMC的增殖及NF－κB核轉移的影響，評價小檗堿體外抗糖尿病血管病變作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

清潔級SD大鼠，雄性，體重200－240g，由瀘州醫學院實驗動物科提供（合格證號：川醫動字2401115）。

1.1.2 樣品及試劑

小檗堿（陜西森弗生物技術公司，純度99%，黃色結晶粉末）；鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma公司，批號 S0130）；RPMI1640（GIBCO公司）；胰蛋白酶（美國Sigma公司）；胎牛血清（天津灝洋生物制品科技責任有限公司）；CCK－8（碧云天生物技術研究所）；免疫組化染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；NF－κB激活－核轉運檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所）；DAB顯色劑（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.1.3 儀器

倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司，CKX41型）；CO2培養箱（日本Sanyo公司，MCO－15AC型）；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司，SW－CJ－1F型）；離心機（北京醫用離心機廠，LG10－3A型）；電子天平（上海民橋精密科學儀器有限公司，FA1104N型）；超低溫冰箱（日本Sanyo公司，MDF－192型）；高壓消毒鍋（上海申安醫療器械廠，LDZX－40BI型）；酶標分析儀（北京普朗新技術有限公司，DNM－9602型）；優普超純水機（成都超純科技有限公司，UPH－IV－10T型）；激光共聚焦掃描顯微鏡（德國LEICA公司，TCS SP5型）。日本京都血糖儀（日本愛科來株式會社，GT－1640型）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型建立

大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ，pH 4.5，0.1%枸櫞酸緩沖液新鮮配制）55mg·kg－1造糖尿病大鼠模型。72h后采用大鼠斷尾取血測血糖值，連續測3d。以血糖水平＞16.7mmol·L－1為糖尿病建模成功。

1.2.2 血管平滑肌細胞的培養

取建模成功大鼠正常喂飼1M后頸椎脫臼處死，75%酒精浸泡2－3min，在無菌環境中迅速取出胸主動脈，剝去血管外膜，去除內膜，取中膜血管平滑肌，剪成1.5－2.0mm3大小的組織塊，平鋪于培養瓶，加入含血清的RPMI1640，放入37℃、5%CO2培養箱中靜置培養3d，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況。

1.2.3 血管平滑肌細胞的鑒定

（1）用相差倒置顯微鏡觀察細胞。（2）SMA免疫組織化學染色：將細胞接種于置有小玻片的6孔板中，培養至細胞成致密單層后取出玻片，PBS沖洗后用冷丙酮固定，二步法進行SMA免疫組織化學染色。

1.2.4 細胞生長曲線測定

取生長良好細胞，胰酶消化后計數，調整細胞為5×104·ml－1接種24孔板。24h后開始計數細胞，以后每隔24h計數一次，每次取3個復孔，連續計數7d，計算平均值。根據結果，以單位細胞數（細胞數·ml－1）為縱坐標，時間為橫坐標繪制生長曲線。

1.2.5 小檗堿50%抑制率濃度測定

將96孔板分為空白（培養基）、陰性對照（細胞＋培養基）、藥物 對 照 （藥 物 ＋ 培 養 基）和 60，30，15，7.5，3.75，1.875μmol·L－1小檗堿組（細胞＋培養基＋藥物），取生長良好的糖尿病VSMC細胞，調濃度為1×105·L－1后接種于96孔細胞培養板，采用CCK－8法測定相應的吸光度（Absorbent，A）值，按公式（1－A實驗÷A對照）×100%得出不同濃度對應的抑制率，計算50%抑制率濃度（IC50）。

1.2.6 NF－κB核轉運檢測

調整VSMC細胞濃度為1×105·L－1接種于6孔板中（板中事先放蓋玻片），培養1d待細胞貼壁，加入60，30，15，7.5，3.75，1.875μmol·L－1小檗堿培養1d，按 NF－κB激活－核轉運檢測試劑盒說明書進行操作。于波長460nm處在共聚焦顯微鏡下觀察細胞核、細胞漿顏色，拍照。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 糖尿病血管平滑肌的鑒定

倒置相差顯微鏡下單個平滑肌細胞呈梭形，扇形或三角形狀，有多個細胞突起，胞漿豐富，胞質密度高，不透明，核卵圓形居中，有多個核仁。細胞生長致密時平行排列成束，部分重疊，表現為旋渦狀生長，見圖1。經特異的平滑肌α－actin免疫細胞化學染色后，胞漿著色，呈陽性反應，高倍鏡下可見胞漿內大量棕色、與細胞長軸平行的纖維細絲，即平滑肌α肌動蛋白絲，見圖2。

圖1 糖尿病血管平滑肌第五代照片（×100）

圖2 糖尿病血管平滑肌細胞的α－SM action鑒定

2.2 正常組與糖尿病組大鼠血管平滑肌生長曲線比較

可見兩者細胞增長程度與天數呈S型關系，但糖尿病組血管平滑肌生長速度比正常組快（圖3）。

圖3 糖尿病大鼠與正常組VSMC生長曲線比較

2.3 小檗堿50%抑制率濃度

小檗堿對糖尿病血管平滑肌細胞增殖抑制呈明顯的劑量相關性，其IC50值為6.001±0.853μmol·L－1。小檗堿對正常血管平滑肌細胞生長有一定抑制作用，其IC50值為18.229±0.434μmol·L－1同模型組比較有顯著差異性（P＜0.05）。

2.4 小檗堿對VSMCs中NF－κB核轉位的影響

正常組血管平滑肌細胞呈梭形，扇形或三角形狀，散在成簇生長，胞質中有中等強度紅色熒光著色，胞核為藍色熒光著色（圖4A），糖尿病組VSMCs胞質中紅色著色稍減弱，胞核中紅色熒光著色強（圖4B），小檗堿組可見胞質中的紅色較糖尿病組強，正常組弱，胞核中紅色著色較模型組弱，正常組強（圖4C）。

圖4 不同狀態下糖尿病大鼠VSMCs中NF－κB分布 （×200）

3 討論

糖尿病患者發生心血管并發癥的危險性較正常人高3－4倍，糖尿病大血管并發癥是造成糖尿病病人殘疾和死亡的主要原因之一，最常見的表現就是發生動脈粥樣硬化，常累及大血管［4］。VSMC是動脈壁的主要成分，在血管內膜增生及血管重塑中起重要作用。糖尿病慢性血管病變的主要發病機制VSMC增殖并遷移入內膜，同時產生過量的細胞外基質，導致纖維組織增生，最終形成斑塊或血拴［5］。

NF－κB是存在于細胞漿中的一種快反應轉錄因子，參與了動脈粥樣硬化的過程。研究顯示動脈粥樣硬化的VSMC和巨噬細胞中都大量存在激活的NF－κB［6］。Ramana KV等的研究直接證明了NF－κB調節VSMC增殖的重要作用［7］。NF－κB激活參與糖尿病血管病變也得到了證實：糖尿病時，在某些刺激因素如AGEs、氧化應激、脂代謝紊亂及細胞因子等的作用下，NF－κB被激活后即發生核轉位，P65亞基由胞質轉移至胞核，與特定基因啟動子或增強子上的特異性反應元件結合，調節基因轉錄，啟動血管細胞粘附分子－1（VCAM－1）合成，促進單核細胞與血管內皮細胞的粘附，從而導致動脈粥樣硬化的發生［8］。

本研究觀察到體外培養糖尿病VSMC生長速度明顯高于正常血管平滑肌，同時糖尿病大鼠VSMC出現NF－κB的核轉移，提示糖尿病 VSMC有異常增殖，NF－κB在糖尿病大鼠VSMC中出現激活，與文獻報告一致。采用小檗堿干預后，小檗堿各劑量組明顯抑制血管平滑肌的增殖，并抑制了NF－κB的核轉移，提示小檗堿能夠抑制糖尿病血管平滑肌的異常增殖，而此作用可能與抑制NF－κB的核轉移有關。至于與其他血管異常增殖因素有無關系尚需進一步研究。

1 李艷平，李新榮，鄧湘蕾.糖尿病大鼠血管平滑肌細胞體外培養方法的探討［J］.東南大學學報（醫學版），2005，24（3）：186－189.

2 殷俊，陳明道，唐金鳳，等.小檗堿對實驗大鼠糖脂代謝的影響［J］.中華糖尿病雜志，2004，12（3）：215－218.

3 陳少萍，陳少慈.小檗堿對肺動脈平滑肌細胞增殖的影響［J］.汕頭大學醫學院學報，2008，21（2）：78－83.

4 姚君厘.糖尿病和大血管病變［J］.上海醫藥，2006，27（6）：253－256.

5 陳柏華.寬葉纈草對兔血管平滑肌細胞增殖及遷移抑制作用的實驗研究［J］.數理醫藥學雜志，2004，17（3）：281－282.

6 龐榮清，潘興華，吳亞玲.三七總皂甙對兔血管平滑肌細胞核因子－κB和細胞周期的影響［J］.中國微循環，2004，8（3）：154－156.

7 Ramana KV，Chandra D，Srivastava S，et al.Aldose reductase mediatesmitogenic signaling in vascular smooth muscle cells［J］.J Biol Chem，2002，277（35）：32063－32070.

8 王芙蓉，高聆，于建中，等.西洛他唑對糖尿病大鼠主動脈VCAM－1 NF－κB及PPARs的影響［J］.中國藥理學通報，2006，22（2）：197－202.