巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium NCIB 8508蔗糖磷酸化酶生物催化合成α-熊果苷的研究

李群良，張欣英，楊克迪，姚評(píng)佳，魏遠(yuǎn)安

(1.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧530004； 2.廣西大學(xué)廣西亞熱帶生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧530004)

熊果苷(Arbutin)，又名熊果甙、熊果素、熊果葉甙、熊果酚甙或楊梅甙，是一種源于杜鵑花科熊果屬的多年生常綠小灌木植物熊果葉子細(xì)胞里的成分，具有良好的皮膚美白效果，廣泛應(yīng)用于化妝品行業(yè)[1]。

熊果苷的制備方法有天然產(chǎn)物提取法、植物組織培養(yǎng)法、化學(xué)合成法以及酶轉(zhuǎn)化法[2]。生物酶法主要以糖基轉(zhuǎn)移酶或糖苷酶作為催化劑，通過(guò)催化糖基轉(zhuǎn)移或逆水解反應(yīng)合成熊果苷，其中轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)中酶底物為雙糖或多糖。糖基轉(zhuǎn)移酶能特異地催化糖基從糖基供體如UDPG衍生物轉(zhuǎn)移到目標(biāo)產(chǎn)物，催化效率較高[3]。迄今為止已發(fā)現(xiàn)Leuconostocmesenteroides、Bacillussubtilis、Bacillusmacerans、Saccharomycescerevisiae、Rhizopussp.以及Xanthomonascampestris等微生物細(xì)胞能轉(zhuǎn)化合成熊果苷[4]。Wu等[5]研究了高密度細(xì)胞培養(yǎng)大腸桿菌表面錨定轉(zhuǎn)糖基酶作為全細(xì)胞生物催化劑合成α-熊果苷。Kitao等[6]首次報(bào)道了用Leuconostocmesenteroides蔗糖磷酸化酶轉(zhuǎn)化合成α-熊果苷。通過(guò)蔗糖磷酸化酶催化合成的熊果苷只有α-熊果苷，相比β-熊果苷，其美白效果高10倍以上，且不抑制人體細(xì)胞[7]。利用蔗糖磷酸化酶催化合成α-熊果苷具有專一性強(qiáng)、產(chǎn)品純度高及生產(chǎn)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，因此意義重大。

在前期研究中，作者首次驗(yàn)證并鑒定了巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumNCIB 8508中存在蔗糖磷酸化酶[8]，在此對(duì)該蔗糖磷酸化酶催化蔗糖與對(duì)苯二酚合成α-熊果苷進(jìn)行了初步研究，其反應(yīng)式如下：

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株、試劑與培養(yǎng)基

巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumNCIM 2087(即巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumNCIB 8508)購(gòu)于印度浦那國(guó)家化學(xué)實(shí)驗(yàn)室(National Chemical Laboratory，Pune 411008，India)。

α-熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma 公司，其它試劑為生化試劑。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，蛋白胨1.5 g，NaCl 0.5 g，牛肉膏0.05 g，蒸餾水100 mL，pH值7.0。

1.2 蔗糖磷酸化酶粗酶液的制備

無(wú)菌操作下，取一環(huán)菌株于種子培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)8 h，吸取發(fā)酵液分裝到新種子培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，8000 r·min-1冷凍離心20 min后收集菌體，用緩沖溶液洗滌菌體2次，超聲破碎細(xì)胞，離心，取上清液即為胞內(nèi)粗酶液。

1.3 α-熊果苷的生物合成

取上述胞內(nèi)粗酶液5 mL(其中濕菌體濃度為50 mg·mL-1)，加入反應(yīng)物蔗糖和對(duì)苯二酚，30℃、180 r·min-1搖床反應(yīng)24 h。取1 mL反應(yīng)液，離心取上清液進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。對(duì)苯二酚的轉(zhuǎn)化率(x1)和選擇性(x2)依下式計(jì)算：

式中：M1為加入到反應(yīng)液中的對(duì)苯二酚摩爾量；M2為反應(yīng)消耗掉的對(duì)苯二酚摩爾量；M3為對(duì)應(yīng)生成α-熊果苷的對(duì)苯二酚摩爾量。

1.4 高效液相色譜檢測(cè)條件

色譜條件：色譜柱為DiamonsilTMC18柱，5 μm，250 mm×4.6 mm； 柱溫25℃； 流動(dòng)相為H2O ∶CH3OH = 95∶5；流速1 mL·min-1；檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 緩沖溶液pH值對(duì)反應(yīng)的影響

在反應(yīng)底物對(duì)苯二酚濃度為5 mmol·L-1、對(duì)苯二酚與蔗糖摩爾比為1∶4的條件下，考察緩沖溶液pH值對(duì)反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 緩沖溶液pH值對(duì)反應(yīng)的影響

從圖1可知，當(dāng)緩沖溶液pH值為6.5時(shí)，α-熊果苷含量最大，對(duì)苯二酚的選擇性達(dá)到最高、轉(zhuǎn)化率也較高，這說(shuō)明在pH值為6.5的緩沖溶液反應(yīng)體系中，轉(zhuǎn)糖基作用最佳，且殘余對(duì)苯二酚量最少。這與Nomura等[9]報(bào)道的一致，當(dāng)蔗糖磷酸化酶催化反應(yīng)中受體為氫醌一族時(shí)，轉(zhuǎn)糖基作用的最適pH值偏中性。

2.2 緩沖溶液濃度對(duì)反應(yīng)的影響

考察磷酸鹽緩沖溶液(pH值為6.5)濃度對(duì)反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 緩沖溶液濃度對(duì)反應(yīng)的影響

從圖2可知，緩沖溶液濃度對(duì)α-熊果苷含量影響不是很明顯，緩沖溶液濃度達(dá)到30 mmol·L-1時(shí)，α-熊果苷含量最大，此時(shí)對(duì)苯二酚的選擇性也達(dá)到最高，但其轉(zhuǎn)化率相對(duì)最低。

2.3 對(duì)苯二酚濃度對(duì)反應(yīng)的影響

50 mg·mL-1濕菌體所含蔗糖磷酸化酶量為定值，底物的起始濃度較低時(shí)，蔗糖磷酸化酶催化反應(yīng)速度與對(duì)苯二酚濃度成正比，即生成的α-熊果苷量隨對(duì)苯二酚濃度的增加而增大；但當(dāng)對(duì)苯二酚濃度超過(guò)一定值時(shí)，催化反應(yīng)生成的α-熊果苷量不再隨著對(duì)苯二酚濃度的增加而增大。考察對(duì)苯二酚濃度對(duì)反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 對(duì)苯二酚濃度對(duì)反應(yīng)的影響

從圖3可知，對(duì)苯二酚的選擇性和轉(zhuǎn)化率均隨著其濃度的增加先升高后降低，當(dāng)對(duì)苯二酚濃度為5 mmol·L-1時(shí)，α-熊果苷含量最大，對(duì)苯二酚的選擇性與轉(zhuǎn)化率也達(dá)到最高。

2.4 反應(yīng)物摩爾比對(duì)反應(yīng)的影響

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)增加蔗糖的量來(lái)提高對(duì)苯二酚的轉(zhuǎn)化率，從而提高α-熊果苷的產(chǎn)量。考察反應(yīng)物摩爾比(對(duì)苯二酚與蔗糖摩爾比，下同)對(duì)反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 反應(yīng)物摩爾比對(duì)反應(yīng)的影響

從圖4可知，對(duì)苯二酚與蔗糖的摩爾比為1∶5時(shí)，α-熊果苷含量最大，對(duì)苯二酚的選擇性與轉(zhuǎn)化率也達(dá)到最高；繼續(xù)增加蔗糖的量，對(duì)苯二酚的選擇性與轉(zhuǎn)化率反而有所下降。

2.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響

考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響

從圖5可知，反應(yīng)時(shí)間為24 h時(shí)，對(duì)苯二酚的選擇性及α-熊果苷含量達(dá)到最高；繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，對(duì)苯二酚的選擇性及α-熊果苷含量逐漸下降，而對(duì)苯二酚轉(zhuǎn)化率則逐漸上升，這可能與粗酶液中含有其它催化酶有關(guān)。

3 結(jié)論

采用巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumNCIB 8508蔗糖磷酸化酶催化合成α-熊果苷，確定最佳反應(yīng)條件如下：濕菌體50 mg·mL-1破碎細(xì)胞粗酶液催化合成α-熊果苷，pH值為6.5的磷酸鹽緩沖溶液濃度為30 mmol·L-1，反應(yīng)溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 r·min-1，對(duì)苯二酚濃度為5 mmol·L-1，對(duì)苯二酚與蔗糖摩爾比為1∶5，反應(yīng)時(shí)間為24 h。在此條件下，α-熊果苷含量達(dá)0.35 mg·mL-1，對(duì)苯二酚選擇性為4.0%，對(duì)苯二酚轉(zhuǎn)化率為74%。

由于實(shí)驗(yàn)用酶為蔗糖磷酸化酶粗酶液，酶含量少，其催化合成α-熊果苷相對(duì)有限，致使反應(yīng)物選擇性較低。為了進(jìn)一步提高α-熊果苷產(chǎn)量，今后研究中可利用分子生物學(xué)方法構(gòu)建高表達(dá)蔗糖磷酸化酶基因的工程菌，以獲得酶活力高、穩(wěn)定性好的蔗糖磷酸化酶用于α-熊果苷的生產(chǎn)。

[1] 郭靜，徐平，金立元.熊果苷的研究進(jìn)展[J].寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2008，30(3)：281-283.

[2] 郭起，陳朗秋，蔡進(jìn)，等.熊果苷的合成新方法[J].化學(xué)試劑，2010，32(1)：17-20.

[3] 周防震，郭勇.生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)熊果苷的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(26)：12393-12394，12396.

[4] 梁曉夏，龐宗文，梁靜娟，等.生物催化合成熊果苷的微生物的篩選研究[J].現(xiàn)代食品科技，2007，23(7)：22-25，31.

[5] Wu P H，Nair G R，Chu I M，et al.High cell density cultivation ofEscherichiacoliwith surface anchored transglucosidase for use as whole-cell biocatalyst for alpha-arbutin synthesis[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2008，35(2)：95-101.

[6] Kitao Satoshi，Sekine Hiroshi.α-D-Glucosyl transfer to phenolic compounds by sucrose phosphorylase fromLeuconostocmesenteroidesand production ofα-arbutin[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry，1994，58(1)：38-42.

[7] 侯顧偉，馬江鋒，隋姍姍，等.蔗糖磷酸化酶制備及應(yīng)用的研究進(jìn)展[J] .中國(guó)釀造，2010，(6)：17-20.

[8] 李群良，張欣英，姚評(píng)佳，等.巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumNCIB 8508蔗糖磷酸化酶的分離鑒定[J].化學(xué)與生物工程，2010，27(12)：61-64.

[9] Nomura K，Sugimoto K，Nishiura H，et al.Glucosylation of acetic acid by sucrose phosphorylase[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2008，72(1)：82-87.