大孔吸附樹脂分離純化普那霉素的研究

張雪霞，李 寧，李曉露，王 健，王海燕，林 毅，王秀捧，蔣 沁

(微生物藥物國家工程研究中心，河北省工業微生物代謝工程技術研究中心，華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司，河北 石家莊 050015)

普那霉素(Pristinamycin)是由始旋鏈霉菌產生的一種鏈陽性菌素類抗生素，對包括甲氧西林耐藥的金黃色葡萄球菌、萬古霉素耐藥的腸球菌等在內的大多數革蘭氏陽性菌均具有較強的殺菌活性，且抗生素后效應較長，是治療頑固性革蘭氏陽性菌感染的特選藥物[1]。

普那霉素由兩類化學性質不同的物質組成，分別是屬于B族鏈陽性菌素的普那霉素Ⅰ和屬于A族鏈陽性菌素的普那霉素Ⅱ，兩者的組合比例大約是30%的普那霉素Ⅰ和70%的普那霉素Ⅱ。由于普那霉素能溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯以及三氯甲烷，微溶于水，不溶于石油醚[2]，因此，分離純化一般采用溶媒萃取法[3～5]。但此法耗用大量溶媒、成本較高、收率較低。

作者在此將普那霉素發酵液預處理后，用XAD 1600大孔吸附樹脂進行吸附，經洗脫、濃縮、結晶、干燥，得到了高純度普那霉素，具有良好的應用前景。

1 實驗

1.1 試藥、試劑與儀器

普那霉素發酵液，華北制藥集團新藥公司。

普那霉素ⅠA、ⅡA對照品(純度≥99%)，自制；XAD1600、XAD7大孔吸附樹脂，上海安瀾德有限公司；D312、HZ816、HZ818大孔吸附樹脂，上海華震科技有限公司；超純水，自制；乙腈，色譜純，美國Merck公司；乙醇，工業級；其它試劑均為國產分析純。

高效液相色譜儀(996檢測器，515泵)，Waters；Loborata 4000型旋轉蒸發器，Heidolph公司；PHS-3C 型酸度計，上海雷磁儀器廠；TGL-16G型高速離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.2 預處理

1.2.1 樹脂的預處理及再生

先用乙醇充分浸泡樹脂，除去致孔劑、色素和雜質，用水反復洗滌至洗滌液加乙醇后無白色渾濁為止；然后用4 BV的2 mol·L-1HCl 溶液攪拌浸泡4 h，用蒸餾水洗至中性；再用4 BV的2 mol·L-1NaOH 溶液攪拌浸泡4 h，洗至中性，備用。再生方法與預處理基本相同。

1.2.2 發酵液預處理

將普那霉素發酵液用鹽酸調pH值至3.5～4.0后，加入1%(質量濃度)珍珠巖助濾劑，攪拌均勻后板框壓濾，得到普那霉素濾液。

1.3 吸附條件研究

1.3.1 吸附樹脂的篩選

分別量取5種大孔吸附樹脂2.0 g和100 mL 普那霉素濾液于250 mL錐形瓶中，于60 r·min-1、30 ℃振蕩5 h，取上清液測單位，按式(1)計算樹脂靜態吸附量(mg·g-1)。傾出上清液，各加入20 mL 95%乙醇，密封，于60 r·min-1、30 ℃振蕩5 h，取洗脫液測單位，按式(2)計算樹脂解吸收率(%)。每組實驗做3次平行實驗，取平均值。

(1)

(2)

以樹脂對普那霉素的靜態吸附量為主要篩選指標，并結合解吸收率進行篩選。

1.3.2 動態吸附實驗

分別取20 mL樹脂于3根玻璃柱(2.2 cm×22 cm)中，自上而下加入普那霉素濾液，流速分別為3 BV·h-1、 2 BV·h-1、1 BV·h-1，在出口處每50 mL 為一個樣品，測各樣品單位，計算泄漏率(%)。

1.4 解吸條件研究

XAD1600大孔吸附樹脂吸附飽和后，樹脂的顏色很深。為了提高普那霉素產品含量并降低色素比值，采用定量的不同梯度的乙醇-酸水(含0.1%的乙酸)進行凈化及洗脫。

取XAD1600大孔吸附樹脂20 mL裝柱，普那霉素濾液500 mL(含普那霉素1006 mg)上柱，控制流速為2 BV·h-1，上樣完畢后，分別采用pH值為4.0的20%乙醇-80%酸水、40%乙醇-60%酸水、70%乙醇-30%酸水、90%乙醇-10%酸水各80 mL進行洗脫，洗脫流速為0.5 BV·h-1，分管收集乙醇洗脫液，HPLC在線檢測，計算洗脫液中普那霉素的含量和解吸收率。

1.5 萃取與結晶

用等體積乙酸乙酯萃取洗脫液2次，合并乙酸乙酯相，用無水硫酸鈉脫水后，40 ℃減壓濃縮至10 mL，冷庫靜置12 h，抽濾，得到普那霉素濕粉，干燥，得淡黃色普那霉素精粉。

1.6 HPLC條件

色譜條件：色譜柱為Hypersil C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.05%三氟乙酸水(50∶50)，檢測波長210 nm，流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。普那霉素保留時間為8.5 min。

分別精密稱取普那霉素對照品ⅠA 15 mg、ⅡA 35 mg，置于50 mL容量瓶中，用流動相溶解，取10 μL注入色譜儀，采用外標法按色譜條件進行測定，計算峰面積。測得普那霉素平均回收率為99.8%(n=5)，RSD為0.26%；最低檢測濃度為0.013 mg·L-1。

2 結果與討論

2.1 樹脂篩選結果

5種大孔吸附樹脂的靜態吸附量和解吸收率見表1。

表1 5種大孔吸附樹脂的靜態吸附量和解吸收率

由表1可以看出，XAD1600大孔吸附樹脂對活性組分的靜態吸附量明顯大于其它樹脂且解吸收率也最高，可以達到對活性組分的富集作用。故選用XAD1600大孔吸附樹脂進行后續實驗。

2.2 流速對泄漏率的影響(圖1)

圖1 流速對泄漏率的影響

由圖1可以看出，流速較慢時泄漏率較低，有利于普那霉素的吸附。這是因為，流速減緩，普那霉素與樹脂的接觸時間延長，有利于樹脂吸附，從而降低了泄漏率。當流速從2 BV·h-1降至1 BV·h-1時，普那霉素的泄漏率相差不大，同時隨著流速的減慢，操作時間延長，提高了生產成本。綜合考慮，選擇流速為2 BV·h-1。

2.3 解吸條件的選擇

乙醇體積分數不同的洗脫液中普那霉素的含量及解吸收率見表2。

表2 乙醇體積分數不同的洗脫液中普那霉素的含量及解吸收率

由表2可以看出，乙醇體積分數為90%的洗脫液中普那霉素的含量及解吸收率最高。這是因為，普那霉素ⅠA的極性較弱，當乙醇含量低時，洗脫液中主要為ⅡA，導致ⅠA損失較大。因此，普那霉素兩個活性組分主要集中在90%乙酸-10%酸水(pH=4.0)洗脫液中。故確定洗脫條件為：先用40%乙醇-60%酸水洗脫去除色素及極性大雜質，再用90%乙醇-10%酸水(pH=4.0)洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮除去乙醇，得普那霉素濃縮液。

2.4 驗證實驗

取XAD1600大孔吸附樹脂500 mL裝柱，將普那霉素濾液2200 mL(含普那霉素21.6 g)上柱，控制流速為2 BV·h-1，上樣完畢后，分別采用pH值為4.0的40%乙醇-60%酸水、90%乙醇-10%酸水各2000 mL 洗脫，流速為0.5 BV·h-1，分段收集洗脫液，HPLC在線檢測，合并高單位洗脫液，濃縮，萃取，結晶，干燥，得普那霉素精粉，重復3次，結果見表3。

表3 不同批次普那霉素分離純化效果(n=3)

從表3可見，普那霉素含量達到98.5%以上，收率達64%左右，產品質量符合法國藥典規定。表明該工藝穩定，收率高，適合于普那霉素的分離純化。

3 結論

采用大孔吸附樹脂XAD1600分離純化普那霉素，樹脂的靜態吸附量達到45.22 mg·g-1。在吸附流速為2 BV·h-1時吸附飽和后，用40%乙醇-60%酸水洗脫去除色素及極性大雜質，然后再以0.5 BV·h-1的流速用90%乙醇-10%酸水(pH=4.0)洗脫，得到含量98.5%以上、收率64%左右的普那霉素精粉。該方法生產成本低、安全性高、收率穩定，具有較高的應用價值。

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[3] Paquet V，Myint M，Roque C，et al.Partitioning of pristinamycins in aqueous two-phase systems：A first step toward the development of antibiotic production by extractive fermentation[J].Biotechnol Bioeng，1994，44(4)：445-451.

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