離子對(duì)色譜法測定細(xì)胞內(nèi)α-酮戊二酸含量

陶國慶，李鳳辰，邵 菲，付水林，宮 衡

(華東理工大學(xué) 生物反應(yīng)器工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

研究微生物發(fā)酵過程中細(xì)胞內(nèi)代謝物的變化對(duì)深入了解及指導(dǎo)發(fā)酵過程具有非常重要的意義。α-酮戊二酸是細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的中間代謝產(chǎn)物，不僅是三羧酸循環(huán)的中間體，還是氮源調(diào)節(jié)中的信號(hào)分子[1]。研究認(rèn)為，α-酮戊二酸是氨合成的前體，也是氮源缺乏的信號(hào)[2]。

目前，測定細(xì)胞內(nèi)代謝物的含量大多采用HPLC梯度洗脫的方法，過程較為繁瑣[3]。離子對(duì)色譜法是將一種與溶質(zhì)分子電荷相反的離子加到流動(dòng)相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水型離子對(duì)化合物，從而控制溶質(zhì)離子在色譜中的保留行為[4]。作者在此采用離子對(duì)色譜法測定大腸桿菌BL21中α-酮戊二酸的含量，操作簡單，結(jié)果可靠。為微生物發(fā)酵過程分析提供了一種有效的途徑。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株、試劑與儀器

菌株：大腸桿菌BL21。

磷酸氫二銨、磷酸、α-酮戊二酸，分析純；10%四丁基氫氧化銨水溶液；甲醇，色譜純；水為三次重蒸水。

Waters型高效液相色譜儀；超聲波振蕩儀；真空抽濾儀。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件的建立

(1)色譜分析柱的選擇

C18反相柱被廣泛用于各類物質(zhì)的分析，而色譜柱又因生產(chǎn)廠家及填料不同，其分離效果也不同。先后選用Waters symmetry-C18柱、Diamonsil-C18柱及Platisil-C18柱來測定大腸桿菌BL21中α-酮戊二酸的含量，比較分析效果，以確定最佳色譜分析柱。

(2)檢測波長的選擇

分別在214 nm、233 nm、254 nm處檢測α-酮戊二酸標(biāo)準(zhǔn)品含量，比較分析結(jié)果，確定最佳波長。

(3)流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)室條件下分離酸性物質(zhì)常加入磷酸鹽緩沖溶液，常用磷酸鹽有KH2PO4、(NH4)2HPO4等，本實(shí)驗(yàn)選用(NH4)2HPO4。由于目標(biāo)物α-酮戊二酸是弱酸，在水溶液中存在解離平衡，解離程度受溶液pH值的控制，故必須選擇合適的pH值。為達(dá)到理想的分離效果，還需要選擇合適的離子對(duì)試劑。

1.2.2 樣品處理

(1)樣品的滅活

液氮滅活法：快速取5 mL發(fā)酵液樣品，投入液氮，迅速降低細(xì)胞內(nèi)溫度以抑制酶活性，冰上解凍后收集菌體。

(2)代謝物的抽提[5]

冰甲醇法：在收集的菌體中加1.5 mL 50%冰甲醇(-20 ℃)，打散，置液氮中1 min，冰上放置10 min，反復(fù)3次。融化后，于11 000 r·min-1、4 ℃離心15 min，取上清，-80 ℃保存。

1.2.3 樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱量0.0500 gα-酮戊二酸標(biāo)準(zhǔn)品，純水溶解，定容至50 mL容量瓶。依次稀釋10倍、20倍、50倍、100倍，得到0.704 mmol·L-1、0.352 mmol·L-1、0.141 mmol·L-1、0.070 mmol·L-1梯度濃度的α-酮戊二酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件

通過實(shí)驗(yàn)，確定色譜條件如下：色譜柱為Platisil-C18柱；流動(dòng)相為0.5%(NH4)2HPO4-5 mmol·L-1四丁基氫氧化銨，H3PO4調(diào)pH值4.0；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長為214 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 HPLC圖譜

在確定的色譜條件下，α-酮戊二酸標(biāo)準(zhǔn)品和發(fā)酵液樣品的HPLC圖譜見圖1。

圖1 α-酮戊二酸標(biāo)準(zhǔn)品(a)和樣品(b)的HPLC圖譜

由圖1可知，α-酮戊二酸的出峰時(shí)間為45.14 min，發(fā)酵液樣品中α-酮戊二酸能夠很好地與其它組分分離。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以α-酮戊二酸濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。

圖2 α-酮戊二酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

擬合得線性回歸方程：y=867645x-8426，相關(guān)系數(shù)R2為0.9996，線性關(guān)系極顯著。

2.4 穩(wěn)定性

由于抽提獲得的樣品內(nèi)代謝物多而復(fù)雜且分析儀器為自動(dòng)進(jìn)樣，故有必要進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。于-80 ℃取出樣品溶液，12 h內(nèi)每3 h測定其中α-酮戊二酸含量，結(jié)果見表1。

表1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，樣品在9 h內(nèi)是穩(wěn)定的(RSD=0.42%)；9 h后樣品不太穩(wěn)定，α-酮戊二酸含量大幅下降，12 h的RSD為1.07%。可見，常溫放置抽提樣品不宜超過9 h，否則目標(biāo)物α-酮戊二酸會(huì)發(fā)生一定程度的降解。

2.5 精密度

取同一樣品連續(xù)進(jìn)樣5次，進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)

由表2可知，連續(xù)進(jìn)樣5次得到α-酮戊二酸含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差僅為0.38%，表明方法的精密度較高。

2.6 回收率

取已測定α-酮戊二酸含量的樣品，準(zhǔn)確添加一定量α-酮戊二酸標(biāo)準(zhǔn)品，分析檢測，結(jié)果見表3。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)(n=5)

由表3可知，細(xì)胞內(nèi)α-酮戊二酸的平均回收率為99.38%。

2.7 討論

(1)為監(jiān)控微生物發(fā)酵過程，代謝物必須凍結(jié)在取樣時(shí)刻，大多數(shù)文獻(xiàn)采用冰甲醇滅活，本實(shí)驗(yàn)利用液氮滅活，更加迅速。

(2)在分離細(xì)胞內(nèi)代謝物時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)大部分出峰較快，為此加入離子對(duì)試劑(四丁基氫氧化銨，常用于分離酸性物質(zhì))以控制保留時(shí)間；而離子對(duì)試劑的濃度也必須在合適范圍，太低不能有效改善分離效果，過高時(shí)色譜柱難以清洗，縮短其使用壽命。綜合考慮，選擇5 mmol·L-1的離子對(duì)試劑較為適宜。

(3)α-酮戊二酸pKa為5.7，理論上只要提高H+濃度，使pH值小于5.7就可以抑制α-酮戊二酸的解離。在確定的色譜條件下，考察pH值為5.0、4.0、2.5對(duì)分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH值以4.0時(shí)分離效果最好。因此，選擇pH值以4.0較為適宜。

3 結(jié)論

建立了測定細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵代謝物α-酮戊二酸含量的離子對(duì)色譜方法：Platisil C18柱，以0.5%(NH4)2HPO4-5 mmol·L-1四丁基氫氧化銨為流動(dòng)相，H3PO4調(diào)pH值為4.0，檢測波長為214 nm。結(jié)果表明，α-酮戊二酸與其它代謝物分離效果較好，方法線性相關(guān)性高(R2=0.9996)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.38%，平均回收率達(dá)99.38%。為微生物發(fā)酵過程分析提供了一條有效的途徑。

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