HPLC法測定鹽酸左布比卡因有關物質及對映體純度

符義剛，李莉娥，李 杰，胡先明

(1.武漢大學藥學院，湖北 武漢 430072；2.宜昌人福藥業有限責任公司，湖北 宜昌 443005)

手性藥物由于其對映異構體之間可能具有不同的藥效學和藥動學性質，近年來引起廣泛的關注。如酰胺類局部麻醉藥布比卡因，其右旋異構體的心肌抑制作用強，但其左旋異構體由于具有較低的神經和心血管毒性而應用于臨床。因此，為了保證鹽酸左布比卡因(Levobupivacaine hydrochloride)臨床應用中安全有效，必須對有關物質及右旋異構體進行控制[1，2]。為了有效地控制鹽酸左布比卡因的含量，作者參照文獻[3]，對HPLC色譜條件和方法進行優化，建立了鹽酸左布比卡因有關物質測定以及對映體純度測定的高效液相色譜方法。

1 實驗

1.1 試藥、試劑與儀器

鹽酸左布比卡因樣品(批號：100601、100701、100801)、鹽酸左布比卡因對照品(批號：100601R)，宜昌人福藥業有限責任公司；鹽酸布比卡因對照品(批號：H2H088)，USP；2，6-二甲基苯胺(批號：S36420-224)，Merck-Schuchardt公司。實驗用水為娃哈哈純凈水；甲醇、乙腈，色譜純；其它試劑均為分析純。

Waters e2695型高效液相色譜儀，Waters 2489紫外檢測器，Epower 2色譜工作站(美國Waters)。

1.2 方法

1.2.1 鹽酸左布比卡因有關物質測定

1.2.1.1 色譜條件

Dikma Platisil ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為磷酸鹽緩沖溶液(取1 mol·L-1磷酸二氫鈉1.3 mL、0.5 mol·L-1磷酸氫二鈉32.5 mL，加水至1000 mL使溶解，調節pH值為8.0)-乙腈(40∶60，體積比)；檢測波長240 nm；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。

1.2.1.2 溶液的制備

(1)供試品溶液

取鹽酸左布比卡因樣品適量，加流動相溶解并稀釋，得到2 mg·mL-1的供試品溶液。

(2)對照溶液

取鹽酸左布比卡因對照品適量，加流動相溶解并稀釋，得到0.02 mg·mL-1的對照溶液。

(3)2，6-二甲基苯胺對照溶液

取2，6-二甲基苯胺適量，加甲醇溶解并稀釋，得到0.2 mg·mL-12，6-二甲基苯胺貯備液；取貯備液適量，加流動相稀釋，得到0.2 μg·mL-12，6-二甲基苯胺對照溶液。

(4)專屬性考察溶液

高溫破壞溶液：取供試品溶液1 mL置于10 mL量瓶中，加水適量，水浴加熱9 h，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

光照破壞溶液：取光照10 d的鹽酸左布比卡因樣品20.2 mg置于10 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.1.3 方法學考察

在上述色譜條件下，分別對鹽酸左布比卡因有關物質進行專屬性、檢測限、溶液穩定性考察，并對3批鹽酸左布比卡因樣品的相關物質進行測定。

1.2.2 對映體純度測定

1.2.2.1 色譜條件

色譜柱為研創MCDP手性柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為三乙胺醋酸溶液(取三乙胺7 mL、醋酸7 mL，加水至1000 mL)-甲醇(70∶30，體積比)；檢測波長215 nm；流速0.5 mL·min-1；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。

1.2.2.2 溶液的制備

(1)供試品溶液

取鹽酸左布比卡因樣品適量，加水溶解并稀釋，得到0.5 mg·mL-1的供試品溶液。

(2)系統適用性溶液

取鹽酸布比卡因對照品適量，加水溶解并稀釋，得到0.2 mg·mL-1的鹽酸布比卡因溶液，即系統適用性溶液。

(3)專屬性考察溶液

高溫破壞溶液：取鹽酸左布比卡因樣品200 mg置于10 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液；取貯備液1 mL置于10 mL量瓶中，加水適量，水浴加熱9 h，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過；取續濾液1 mL置于10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

光照破壞溶液：取光照10 d的鹽酸左布比卡因樣品20.2 mg置于10 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻；取1 mL置于10 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.2.3 方法學考察

在上述色譜條件下，分別對鹽酸左布比卡因對映體純度進行專屬性、峰歸屬、檢測限、重復性考察，并對3批鹽酸左布比卡因樣品的對映體純度進行測定。

2 結果與討論

2.1 鹽酸左布比卡因有關物質測定

2.1.1 專屬性

取各專屬性考察溶液，按1.2.1.1色譜條件進樣測定，計算理論塔板數和分離度，結果見圖1。

a.高溫破壞 b.光照破壞

由圖1可知，鹽酸左布比卡因峰與相鄰降解產物峰能達到有效分離，分離度大于1.5；理論塔板數(以鹽酸左布比卡因計)大于10 000。

2.1.2 檢測限

取鹽酸左布比卡因對照品適量，加流動相溶解并稀釋得到0.02 μg·mL-1鹽酸左布比卡因溶液，取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果表明，鹽酸左布比卡因峰信噪比為3.3,即鹽酸左布比卡因檢測限濃度為0.02 μg·mL-1。

取2，6-二甲基苯胺適量，加流動相稀釋得到0.7 ng·mL-12，6-二甲基苯胺溶液，取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果表明，2，6-二甲基苯胺峰信噪比為2.5，即2，6-二甲基苯胺檢測限濃度為0.7 ng·mL-1。

2.1.3 溶液穩定性

取供試品溶液于室溫分別放置0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h、11 h、12 h，進樣測定。結果表明，溶液在12 h內穩定，RSD為0.6%。

2.1.4 樣品有關物質測定

取3批鹽酸左布比卡因樣品分別制備的供試品溶液及對照溶液、2，6-二甲基苯胺對照溶液，各進樣20 μL，記錄色譜圖，如圖2所示。以不加校正因子的主成分對照法計算最大單個雜質和總雜質，以外標法計算2，6-二甲基苯胺含量。結果表明，3批鹽酸左布比卡因樣品中均未檢出有關物質。

a.供試品溶液 b.對照溶液 c.2，6-二甲基苯胺對照溶液

2.2 對映體純度測定

2.2.1 專屬性

取各專屬性考察溶液，按1.2.2.1色譜條件進樣測定，計算理論塔板數和分離度，結果見圖3。

a.高溫破壞 b.光照破壞

由圖3可知，鹽酸左布比卡因峰與相鄰降解產物及其對映體峰能達到有效分離，分離度大于1.5；理論塔板數(以鹽酸左布比卡因計)大于2000。

2.2.2 峰歸屬

取系統適用性溶液10 μL注入液相色譜儀，出現2個主峰，分別為R-(+)型與S-(-)型鹽酸布比卡因。

取供試品溶液10 μL注入液相色譜儀，出現1個主峰，應為R-(+)型或S-(-)型鹽酸布比卡因。取2%的水溶液測定比旋度為-12.5°，說明供試品為左旋體。因此可確定該色譜條件下對映體出峰順序為：先R-(+)型鹽酸布比卡因峰、后S-(-)型鹽酸布比卡因峰。

2.2.3 檢測限

取鹽酸布比卡因對照品適量，加水溶解并稀釋得到0.4 μg·mL-1鹽酸布比卡因溶液，取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果表明，R-(+)型與S-(-)型鹽酸布比卡因峰信噪比分別為3.3和3.2，則該方法R-(+)型與S-(-)型鹽酸布比卡因檢測限濃度均為0.2 μg·mL-1。

2.2.4 重復性

取系統適用性溶液10 μL注入液相色譜儀，連續進樣6次，記錄色譜圖。結果表明，R-(+)型鹽酸布比卡因峰與S-(-)型鹽酸布比卡因峰分離度均大于1.5；計算AR/(AS+AR)的值[AR、AS分別表示R-(+)型鹽酸布比卡因與S-(-)型鹽酸布比卡因峰面積]，平均為52.0%。表明該方法重復性良好。

2.2.5 對映體純度測定

取3批鹽酸左布比卡因樣品分別制備的供試品溶液及系統適用性溶液，各進樣10 μL，記錄色譜圖。計算AR/(AS+AR)，結果表明，3批鹽酸左布比卡因樣品中均未檢出鹽酸右布比卡因，色譜圖見圖4。

a.系統適用性溶液 b.供試品溶液

2.3 討論

(1)pH值對鹽酸左布比卡因有關物質測定影響較為明顯。鹽酸左布比卡因峰的保留時間隨pH值的減小而縮短。鹽酸左布比卡因為堿性藥物，在偏堿性的條件下有利于在色譜柱上保留。因此，最終選擇pH值8.0的磷酸鹽緩沖溶液作為流動相，相應地需選擇耐堿性的色譜柱。

(2)三乙胺醋酸緩沖溶液是手性分離中常用的緩沖溶液。研究發現，緩沖溶液濃度越大對映體分離效果越好。最終確定以7 mL三乙胺與7 mL醋酸加水至1000 mL的緩沖溶液為最佳。

(3)本研究所討論的鹽酸左布比卡因的質量控制方法中，其有關物質測定所采用的HPLC方法無立體選擇性，測定的實際是鹽酸左布比卡因及其右旋對映體的總量，因此評價原料藥質量時應當綜合對映體純度的測定結果。

3 結論

采用高效液相色譜法，以Dikma Platisil ODS柱測定鹽酸左布比卡因有關物質；以研創MCDP手性柱測定鹽酸左布比卡因對映體純度。結果表明，鹽酸左布比卡因與其中間體及降解產物之間分離良好；鹽酸左布比卡因與其右旋對映體可完全分離(R>1.5)。該方法快速簡便、準確可靠，可用于鹽酸左布比卡因的質量控制。

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