潮間帶產(chǎn)絮凝劑放線菌的篩選及其培養(yǎng)條件的優(yōu)化

耿 強(qiáng)，馮勝科，張 超，劉其友

(1.中國石油大學(xué)(華東)化學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266555；2.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300073；3.中國石化石油化工科學(xué)研究院，北京 100083)

微生物絮凝劑是一類可以使液體中不易降解的固體懸浮顆粒、菌體細(xì)胞及膠體等凝集、沉淀的特殊高分子代謝產(chǎn)物，是高效、廉價、安全、無毒、易降解、不產(chǎn)生二次污染的新型水處理劑[1]。

目前，產(chǎn)絮凝劑微生物的種類很多，主要集中在土壤中的細(xì)菌，專門研究潮間帶產(chǎn)絮凝劑放線菌的報道較少。作者在此系統(tǒng)地對潮間帶具有較好絮凝效果的放線菌進(jìn)行篩選，得到了一株絮凝活性較高的菌株Y-3，優(yōu)化了其培養(yǎng)條件并考察了其對含油廢水的處理效果。

1 實驗

1.1 菌種與培養(yǎng)基

菌種來源于青島開發(fā)區(qū)唐島灣潮間帶底泥。

分離培養(yǎng)基：可溶性淀粉 20 g，NaCl 0.5 g，KNO31 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂 20 g，KCrO40.1 g，海水1000 mL，pH值7.4～7.6。

篩選與發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉 20 g，NaCl 0.5 g，KNO31 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，KCrO40.1 g，海水 1000 mL，pH值7.4～7.6。

保藏培養(yǎng)基：高氏斜面培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選及鑒定

對菌株進(jìn)行初篩和復(fù)篩，確定絮凝效果較好的菌株。采用Nikon TS100型相差生物顯微鏡及成像系統(tǒng)對篩選菌株的形態(tài)、特征進(jìn)行觀察，并通過生理生化實驗[2]進(jìn)行初步鑒定。

1.2.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化

采用單因素實驗，分別考察培養(yǎng)基組成及初始pH值、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速對絮凝效果的影響。

在單因素實驗基礎(chǔ)上，確定培養(yǎng)基以乙醇作為碳源、酵母膏作為氮源，選取4個主要因素即初始pH值、培養(yǎng)溫度、乙醇用量、搖床轉(zhuǎn)速作為放線菌發(fā)酵產(chǎn)絮凝劑的影響因素進(jìn)行正交實驗[3]，正交實驗的因素與水平見表1。

表1 正交實驗的因素與水平

1.2.3 含油廢水絮凝實驗

在500 mL燒杯中加入300 mL含油廢水，用移液槍移取少量微生物絮凝劑，將燒杯置于電子變速攪拌機(jī)攪拌棒下，先快速(200 r·min-1)攪拌2 min，再慢速(60 r·min-1)攪拌6 min，然后靜置10 min。之后從燒杯同一高度取50 mL上清液，測定含油廢水的濁度、石油類和COD去除率。其中COD、濁度、石油類的測定分別采用重鉻酸鉀法、分光光度法和紫外分光光度法[4]。

1.2.4 絮凝率測定方法

采用高嶺土法[5]測定絮凝效果，并加以修正。向250 mL燒杯中加入150 mL 4 g·L-1高嶺土懸浮液、3 mL微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的培養(yǎng)液，放置在六聯(lián)攪拌機(jī)下，插入攪拌葉輪。先快速(200 r·min-1)攪拌1 min，再慢速(60 r·min-1)攪拌3 min，然后靜置5 min。取上清液，用721型分光光度計測定其OD550。同時以蒸餾水代替培養(yǎng)液作對照實驗。絮凝率按下式計算：

式中：A為對照上清液吸光度值；B為樣品上清液吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株篩選與鑒定

2.1.1 菌株的分離與初篩

用高氏一號培養(yǎng)基對唐島灣潮間帶3處底泥樣進(jìn)行分離，結(jié)果顯示高氏一號培養(yǎng)基上沒有或很少菌落形成，說明高氏培養(yǎng)基缺乏海水中的某些微量元素，不適合潮間帶底泥中放線菌的生長。將去離子水改換為海水后共分離出18株放線菌，所測絮凝率如表2所示。菌株絮凝效果分布見圖1。

表2 初篩絮凝活性測定值/%

圖1 放線菌絮凝效果分布圖

由表2和圖1可知，大部分放線菌具有一定絮凝活性，同時出現(xiàn)了絮凝率為負(fù)值的菌株，可能是由于放線菌自身在培養(yǎng)基中的代謝物質(zhì)的影響。對高嶺土具有較高絮凝活性(絮凝率>80%)的放線菌菌株共有3株，占16.67%，對其進(jìn)行含油廢水復(fù)篩實驗。

2.1.2 菌株的復(fù)篩

對初篩得到的3#、4#、10#菌株進(jìn)行含油廢水的絮凝實驗，結(jié)果如表3所示。

表3 復(fù)篩菌株對含油污水的絮凝效果/%

由表3可知，3#菌株不僅對高嶺土具有很高的絮凝活性，對含油廢水絮凝效果也最好，將其命名為Y-3，進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)。

2.1.3 菌株的鑒定

對復(fù)篩得到的Y-3菌株進(jìn)行顯微鏡菌落特征檢測，結(jié)果見圖2。

圖2 Y-3菌株的個體與菌落形態(tài)

由圖2可知，菌株個體為細(xì)桿狀，無鞭毛，菌落呈圓形，氣生菌絲為乳白色，基質(zhì)菌絲為象牙黃，表面粗糙有褶皺呈絨毛狀，邊緣整齊，中間突起。生理生化實驗結(jié)果表明，菌株能利用蔗糖、葡萄糖但不能利用果糖，能使淀粉水解而不能使纖維素水解，能使牛奶凝固、明膠液化，這些特征基本符合放線菌鏈霉菌屬[6]。因此，初步鑒定菌株Y-3為鏈霉菌屬。

2.2 單因素實驗結(jié)果

2.2.1 培養(yǎng)基組成對絮凝效果的影響(表4)

表4 培養(yǎng)基組成的優(yōu)化/%

由表4可知，乙醇為碳源、酵母膏為氮源，放線菌產(chǎn)絮凝劑的絮凝效果較好。乙醇作為碳源，價格低廉并且具有滅菌作用，因此有利于工業(yè)應(yīng)用。酵母膏為天然有機(jī)質(zhì)，富含氮源以外的營養(yǎng)物質(zhì)，利于代謝產(chǎn)物形成，產(chǎn)生的絮體較大。高鹽度的培養(yǎng)基會降低放線菌的數(shù)量，抑制放線菌的生長[7]。因此，培養(yǎng)基宜選擇低鹽度。

2.2.2 培養(yǎng)基初始pH值對絮凝效果的影響(圖3)

圖3 初始pH值對絮凝效果的影響

由圖3可知，在酸性條件下，pH值對絮凝效果的影響不大；當(dāng)培養(yǎng)基偏中性(pH=6.0～7.5)時，絮凝效果最好；而在堿性條件下，絮凝率迅速下降，說明該放線菌所產(chǎn)絮凝劑為陰離子型[4]。

2.2.3 培養(yǎng)溫度對絮凝效果的影響(圖4)

圖4 培養(yǎng)溫度對放線菌發(fā)酵產(chǎn)絮凝劑的影響

2.2.4 搖床轉(zhuǎn)速對絮凝效果的影響(圖5)

圖5 搖床轉(zhuǎn)速對絮凝效果的影響

由圖5可知，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為140 r·min-1時，菌株Y-3所產(chǎn)絮凝劑的絮凝效果最好。

2.3 正交實驗結(jié)果與分析(表5)

表5 放線菌產(chǎn)絮凝劑培養(yǎng)條件優(yōu)化正交實驗結(jié)果與分析

由表5可知，各因素對絮凝效果的影響大小依次為：培養(yǎng)溫度>初始pH值>乙醇用量>搖床轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)溫度對放線菌產(chǎn)絮凝劑的絮凝率影響最大。

綜合考慮，確定最優(yōu)培養(yǎng)條件為A2B2C3D1，即培養(yǎng)溫度30 ℃、初始pH值7.0、乙醇用量35 mL·(L海水)-1、搖床轉(zhuǎn)速130 r·min-1，在此條件下，放線菌Y-3對高嶺土的絮凝率達(dá)到92.76%。

2.4 絮凝劑對含油廢水的絮凝效果

考察在最優(yōu)培養(yǎng)條件下放線菌Y-3所產(chǎn)絮凝劑對含油廢水的處理效果。結(jié)果表明，濁度去除率為66.4%，COD去除率為19.23%，石油類去除率為23.64%，效果較好。

3 結(jié)論

(1)從潮間帶底泥中篩選得到絮凝活性較高的菌株Y-3，優(yōu)化的培養(yǎng)條件為：乙醇為碳源，酵母膏為氮源，低鹽度；培養(yǎng)溫度30 ℃，初始pH值7.0，乙醇用量35 mL·(L海水)-1，搖床轉(zhuǎn)速130 r·min-1。在此條件下，對高嶺土的絮凝率達(dá)到92.76%。

(2)放線菌Y-3對含油廢水具有較好的絮凝效果和一定的降解作用，在最優(yōu)培養(yǎng)條件下，所產(chǎn)絮凝劑對含油廢水的濁度去除率達(dá)到66.4%、COD去除率達(dá)到19.23%、石油類去除率達(dá)到23.64%，具有一定工業(yè)應(yīng)用價值。

[1] 徐美娟，胡惠仁，劉秋娟.環(huán)境友好絮凝劑——微生物絮凝劑[J].上海造紙，2004，35(1)：52-55.

[2] 張武崗，馮俊濤，方香玲，等.放線菌19G-317菌株的鑒定及其抑菌活性研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報，2009，35(3)：243-248.

[3] 潘麗君，陳錦全.試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理[M].南京：東南大學(xué)出版社，2008：110-115.

[4] 國家環(huán)境保護(hù)總局.水和廢水監(jiān)測分析方法(第四版)[M].北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2002.

[5] 石璐.高效微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選及培養(yǎng)條件研究[D].湘潭：湘潭大學(xué)，2003.

[6] 中國科學(xué)院微生物研究所放線菌分類組.鏈霉菌鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社，1975：13-15.

[7] Zhang Yubin，Lin Peng，Wei Xiaoyong，et al.Effect of salinity on microbial densities of soil in the dilution plate technique applied in mangrove areas[J].Acta Ecological Sinica，2008，28(3)：1287-1295.

[8] 葉晶菁，譚天偉.微生物絮凝劑產(chǎn)生菌分離選育及提取鑒定[J].北京化工大學(xué)學(xué)報，2001，28(1)：10-13.

[9] 張平，戴友芝，唐受印.微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的培養(yǎng)條件研究[J].環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備，2005，6(4)：243-248.