紅外光譜法測定虎舌紅提取物中的總黃酮

凌育趙，劉經亮

(1.仲愷農業工程學院化學化工學院，廣東 廣州 510225；2.廣東食品藥品職業學院，廣東 廣州 510520)

虎舌紅(Ardisiamamillata)，又名紅毛氈、寶鼎紅、天仙紅衣、毛涼傘、金絲紅珠等，為紫金牛科紫金牛屬[1]，具有清熱利濕、活血止血、去腐生肌等功效，對跌打損傷、風濕骨痛、肺癆咳嗽、疳積肝炎等均有療效[2]。黃酮類化合物是紫金牛屬植物的主要活性成分之一[3]，用于防治皮膚疾病、增強免疫力和預防心血管疾病等方面[4]，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、降血脂等廣泛的生物活性與功效[5]。

目前，國內對虎舌紅活性成分的研究，主要集中在揮發油、生物堿及多糖類[6～8]，而對虎舌紅黃酮類成分的研究尚未見相關報道。作者在前期研究的基礎上，采用索氏回流法及溶劑萃取法，成功地提取了虎舌紅中的總黃酮，并以蘆丁為標準品，應用紅外光譜儀對提取物中總黃酮的含量進行了測定。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

虎舌紅全草由廣東省農科院芳村花卉基地提供，經仲愷農業工程學院植物研究室鑒定為紫金?？?Myrsinacese)紫金牛屬(Ardisia)虎舌紅。

蘆丁標準品，中國藥品生物制品檢定所；溴化鉀、鹽酸、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、鎂粉等，均為分析純。

IRPrestige21型傅立葉變換紅外光譜儀，美國NICOLET公司；752C型紫外可見分光光度計，上海第三分析儀器廠；KQ3200DE型數控超聲波清洗器，蘇州江東精密儀器有限公司；FA-1004型電子天平，上海精密科學儀器有限公司；RE-52型旋轉蒸發儀，上海亞榮公司。

1.2 虎舌紅總黃酮的提取與鑒定

1.2.1 虎舌紅總黃酮的提取

稱取粉碎過篩的虎舌紅粉末20.0 g，置于燒瓶中，加入8 BV 75%(體積分數，下同)的乙醇，于80 ℃下索氏回流提取5次，每次2.5 h。抽濾，收集濾液，減壓回收乙醇溶劑，揮干，濃縮得浸膏0.45 g。用適量熱水溶解浸膏，趁熱過濾除去不溶物，然后加入1/3體積的石油醚(脫脂，并除去部分色素)，振蕩靜置分層；棄去石油醚溶解物，在萃取后的水溶液中加入1/3體積的乙酸乙酯萃取4次，收集乙酸乙酯相，旋轉蒸發儀揮去溶劑得總黃酮0.38 g，收率1.90%。

1.2.2 虎舌紅總黃酮的鑒定

(1)HCl-鎂粉反應。取上述提取物少許，置于試管中，加75%乙醇 2 mL，在水浴中加熱溶解，滴加濃鹽酸2滴，再加鎂粉約 0.50 g，即發生劇烈反應，生成的泡沫呈明顯紅色，溶液顏色逐漸由黃色變為橙紅色。據此鑒定提取物為黃酮類物質。

(2)紅外光譜鑒定。取烘干后的蘆丁少許，加入一定量的溴化鉀，制成固體壓片，用傅立葉變換紅外光譜儀在掃描范圍 4000～400 cm-1、分辨率 4 cm-1、掃描次數為 4的條件下繪制紅外光譜圖；同法繪制精制虎舌紅提取物的紅外光譜圖，對比鑒定。

2 結果與討論

2.1 虎舌紅總黃酮的紅外光譜分析(圖1)

A.蘆丁標準品 B.虎舌紅提取物

由圖1可知，蘆丁標準品和虎舌紅提取物的紅外光譜分別在3296.90～3425.78 cm-1左右均出現寬而強的吸收峰，是-OH的伸縮振動峰，表明存在酚羥基或糖上的羥基，且數目較大；在2973.34 cm-1處出現弱吸收峰，是碳氫鍵的伸縮振動峰，說明飽和碳上的氫較少；在1655.80 cm-1、1662.15 cm-1處出現 C=O的伸縮振動中強峰，兩者位置和峰型一樣，說明提取物是黃酮類物質；在1614.50 cm-1、1505.81 cm-1處出現強吸收峰，是芳環中C=C的伸縮振動吸收峰，也是黃酮的特征吸收峰；在 1093.21 cm-1左右出現較強吸收峰，是C-O的伸縮振動峰；在1355.60 cm-1、1143.25 cm-1處出現羥基的彎曲振動峰；在 807.28 cm-1處出現苯環鄰位氫引起的吸收峰；在 1000～600 cm-1處出現苯環上取代基位置引起的吸收峰，但峰位置不同，說明提取物與蘆丁的羥基取代位置不同；其它位置的吸收峰基本一致。這些表明，提取物中含有羥基、羰基、碳氧單鍵以及不同位置取代的苯環等官能團，特征吸收峰一致。因此可確定提取物是黃酮類化合物。

2.2 紫外可見分光光度法測定虎舌紅中總黃酮含量

以蘆丁為對照品，采用NaNO2-AlCl3比色法測定總黃酮含量[6]。

2.2.1 標準曲線的繪制

準確移取40 μg·mL-1蘆丁標準溶液0.00 mL、2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、10.00 mL于50 mL容量瓶中，加入0.50 mol·L-1NaNO2溶液1.00 mL，搖勻，靜置5 min；加入0.30 mol·L-1AlCl3溶液1.00 mL，搖勻；加入1.00 mol·L-1NaOH溶液5.00 mL、50%乙醇定容至刻度，放置15 min，于410 nm處測定吸光度。以吸光度(A)對濃度(c)進行線性回歸，得回歸方程為A=0.4275c+0.0003，R=0.9987，蘆丁在0.080～0.400 mg·mL-1范圍內呈良好線性關系。

2.2.2 含量測定

取適量樣品溶液，按2.2.1方法測定吸光度，據回歸方程計算得總黃酮含量為19.54 mg·g-1。

2.3 紅外光譜法測定虎舌紅中總黃酮含量

2.3.1 標準曲線與檢出限

黃酮類化合物4-位大多數有羰基，這是黃酮類化合物分子結構特征。紅外光譜圖中，在 1662.15～1505.81 cm-1范圍內羰基有較強的吸收，其吸收強度與含量有關，且不易受其它峰的影響，因此選擇羰基峰為定量峰，紅外定量峰面積由兩側的峰谷確定。

在定量程序中建立標準品的紅外光譜圖，以1662.15～1505.81 cm-1范圍內吸光度(A)的面積值作為定量值，用傅立葉變換紅外光譜儀的朗伯-比耳定量程序建立標準曲線。以蘆丁質量(M，mg)對峰面積(S)進行線性回歸，得到：M=0.0359S-0.3547，相關系數為0.9803。本方法的檢出限為0.04 mg。

2.3.2 含量測定

準確稱取樣品溶液6份，稱取相應的溴化鉀使質量總和在0.0850～0.0860 g之間。按2.3.1方法繪制紅外光譜圖，應用朗伯-比耳定量程序計算，結果見表1。

表1 紅外光譜測定提取物中總黃酮含量

由表1可知，提取物中總黃酮的平均含量為19.47 mg·g-1。與紫外可見分光光度法測定結果基本一致。

2.3.3 吸光系數K

從紅外光譜圖上得到樣品的吸光度，再根據固體壓片的厚度計算吸光系數K為2.379×103g·cm-1。

2.4 加標回收率實驗

采用測定標準品(蘆丁)和試樣加標回收實驗方法，進行加標回收率實驗，結果見表2。

表2 加標回收率實驗結果

由表2可知，回收率在93.54%～104.35%之間，平均回收率為98.72%；其相對標準偏差(RSD)為 2.09%(n=6)，說明方法精密度高。

3 結論

應用紅外光譜法測得虎舌紅中的總黃酮含量為19.47 mg·g-1，與紫外可見分光光度法測定結果(19.54 mg·g-1)基本一致。紅外光譜法測定虎舌紅中總黃酮含量時吸光系數達到 2.379×103g·cm-1，吸光系數K較小，適合于常量分析，相對標準偏差(RSD)為2.09%(n=6),加標回收率為93.54%～104.35%，平均回收率為98.72%。該法操作簡便、結果可靠，可用于黃酮類有效成分的質量監控。

[1] 盧其能.虎舌紅的生物學特性與組織培養研究[J].江西林業科技，2002，(1)：5-6.

[2] 趙亞，劉合剛.紫金牛屬植物研究近況[J].中草藥，1999，30(3)：228-231.

[3] 姚新生．天然藥物化學(第二版)[M].北京：人民衛生出版社，1996：194.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部[M].北京：化學工業出版社，2000：629.

[5] 黃河勝，馬傳庚，陳志武.黃酮類化合物藥理作用研究進展[J].中國中藥雜志，2000，25(10)：589-592.

[6] 凌育趙，曾滿枝，嚴志云.超臨界萃取氣-質聯用分析虎舌紅揮發油化學成分[J].精細化工，2005，22(10)：766-769.

[7] 凌育趙，曾滿枝.虎舌紅生物堿類成分的提取分離與結構鑒定[J].精細化工，2007，24(7)：667-670.

[8] 凌育趙，曾滿枝.虎舌紅多糖的分離純化與性質研究[J].分析試驗室，2007，26(4)：93-96.