酶聯免疫法快速檢測貝類中腹瀉性貝類毒素

黃玉柳，黃國秋，葉欣宇，黎小正，吳祥慶，楊姝麗，吳明媛

(廣西水產研究所，廣西 南寧 530021)

腹瀉性貝類毒素(Diarrhetic shellfish poisons，DSP)是由有毒赤潮藻類鰭藻屬和原甲藻屬中部分藻種產生的一類脂溶性天然化合物，主要成分為軟海綿酸及其衍生物。有毒藻經雙殼貝類濾食后，其毒素會在貝體內累積，導致貝類食用者中毒，出現腹瀉、惡心、嘔吐及腸胃絞痛等癥狀。

目前，用于DSP檢測的方法主要有小鼠生物法、酶聯免疫法、細胞毒性測試法、酶活力抑制分析法、高效液相色譜法以及液相色譜-質譜聯用等方法[1，2]。食品檢驗部門常用小鼠生物法進行DSP檢驗，但由于該方法對小鼠品種(品系)的要求較高，毒素提取過程復雜，易受雜質干擾，且變異性較高，因而檢測的準確性和專一性較差，不利于調查追蹤污染源以及對染毒貝類進行早期臨控和預警。酶聯免疫檢測方法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是利用抗體和抗原的特異性結合反應建立的免疫化學方法，其靈敏度高、成本低、特異性強、儀器要求不高、樣品前處理簡單，特別適于現場監測和大量樣本快速篩查，近年來在分析化學領域得到迅速發展。作者在此介紹了美國ABRAXIS腹瀉性貝類毒素試劑盒的測定方法，并和傳統的小鼠生物法進行了比較。

1 實驗

1.1 樣品來源

分別于廣西欽州和防城港海域近江牡蠣養殖場采集近江牡蠣樣品20個，于北海海域文蛤養殖場采集文蛤樣品20個，共60個樣品。樣品采集后立即置于冰排中存放，當日送回實驗室檢驗。

1.2 主要試劑與儀器

美國ABRAXIS腹瀉性貝類毒素試劑盒，甲醇。實驗用水為蒸餾水。

酶標比色儀 (BIO-TEK)，離心機，均質器。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的繪制

試劑盒中提供的DSP標準溶液濃度為0 ppb、0.1 ppb、0.2 ppb、0.5 ppb、1.0 ppb、2.0 ppb、5.0 ppb。結果分析可采用商業ELISA分析軟件(4-Parameters，Logit/Log)或手工計算。以每個標準溶液的B/B0為縱坐標(B和B0分別為各標準溶液的吸光度、零標準溶液的吸光度)、岡田酸濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.3.2 樣品前處理

首先除去貝殼，用雙蒸水洗凈貝肉后均質器均質。稱取1 g 均質后的樣品加入6 mL80%(體積分數)甲醇，3500 r·min-1離心10 min，收集上清液；加2 mL 80%甲醇到殘留貝肉組織中，再次3500 r·min-1離心10 min，收集上清液；重復以上步驟，待收集的上清液達到10 mL時，用0.45 μm的濾膜過濾；取10 μL濾液，用緩沖溶液稀釋到1 mL。

1.3.3 試劑盒的測定程序

依次在預包被抗體的微孔板中加入濃度分別為0 ppb、0.1 ppb、0.2 ppb、0.5 ppb、1.0 ppb、2.0 ppb、5.0 ppb的DSP標準溶液和樣品提取液各100 μL。每個測試孔加入50 μL岡田酸酶標記物溶液、50 μL岡田酸抗體溶液，用封口膜蓋上微孔板，輕輕振蕩微孔板30 s，使液體混勻。室溫下孵育60 min。孵育完成后，取掉封口膜，將微孔中的溶液用力地倒入水槽中，用1X的洗液洗板3次，每孔每次至少加入250 μL 1X的洗液。拍板，去掉殘留的洗液。每個測試孔加入150 μL顯色液(底物)。室溫避光孵育20～30 min。每個測試孔加入100 μL反應終止液。用酶標測定儀在450 nm處測量吸光度值。通過標準曲線計算樣品中DSP的含量。

2 結果與討論

2.1 標準曲線(圖1)

圖1 標準曲線

2.2 方法靈敏度和檢測限

本方法靈敏度為1.7 ppb。根據樣品處理稀釋系數，檢測限為0.1 ppb。

2.3 樣品檢測

樣品檢測結果表明，欽州近江牡蠣DSP平均含量為21 ppb；防城港近江牡蠣DSP平均含量為34 ppb；北海文蛤DSP平均含量為23 ppb。

2.4 ELISA法和小鼠生物法檢測DSP的比較(表1)

表1 ELISA法和小鼠生物法的比較

從表1可以看出，ELISA法檢測限遠遠低于小鼠生物法，日常管理中可通過ELISA法快速檢測篩查，更加及時地向管理部門提供食品風險預警信息，有效地控制赤潮毒素造成的影響，減少損失，避免由此帶來的食品衛生風險；同時，在檢出可能染毒的貝類時，及時將貝類轉移到清潔水體中進行一定時間的凈化，使其體內的毒素含量降低到可以食用的水平。

3 結論

采用美國ABRAXIS腹瀉性貝類毒素(DSP)試劑盒對廣西欽州和防城港海域近江牡蠣各20個樣品、北海海域文蛤20個樣品進行了DSP檢測。全部檢測過程在2 h內完成，檢測限為0.1 ppb，靈敏度為1.7 ppb。ELISA法檢測操作方便、成本低，檢測限和靈敏度均滿足要求，非常適于快速檢測，有望作為理想的DSP篩選分析方法之一，在水產品質量快速檢測、養殖區染毒情況調查以及上市貝類質量監控方面發揮重要作用。

[1] 曹際娟，衛鋒，馬惠蕊，等.貝類毒素檢測技術及研究進展[J].檢驗檢疫科學，2004，14(1)：53-56.

[2] 葛虹.貝類毒素的檢測[J].漁業致富指南，2008，(12)：36-37.