頂空氣相色譜法測定雙氫青蒿素磷酸哌喹片中乙醇殘留

貴曉霞，錢佳旦，王小平

浙江華立南湖制藥有限公司，浙江嘉興 314000

雙氫青蒿素哌喹片是雙氫青蒿素和磷酸哌喹組成的復方制劑。雙氫青蒿素為青蒿素的衍生物，是青蒿素在體內的活性物質，對瘧原蟲無性體有較強的殺滅作用，能迅速殺滅瘧原蟲，從而控制瘧疾。磷酸哌喹為4-氨基喹啉類抗瘧藥，抗瘧作用與氯喹類似，影響瘧原蟲紅內期裂殖體的超微結構，能使滋養(yǎng)體食物泡膜和線粒體腫脹，導致其生理功能破壞，從而殺死瘧原蟲，體內藥效學研究提示二者合用具有增效作用，無增毒作用，可延緩瘧原蟲抗藥性的產(chǎn)生。因該藥在制劑生產(chǎn)過程中使用了乙醇進行制粒，乙醇為三類有機溶劑，根據(jù)《中國藥典》2010年版附錄溶劑殘留要求及國際協(xié)調會議（ICH）相關指導原則的要求，乙醇殘留限度為0.5%，需對雙氫青蒿素哌喹片進行殘留乙醇的測定。目前國內外尚未有測定雙氫青蒿素哌喹片中乙醇殘留的方法報道。筆者根據(jù)《中國藥典》2010年版二部附錄殘留溶劑測定法和ICH的要求，建立了毛細管氣相色譜法測定雙氫青蒿素磷酸哌喹片中殘留乙醇的方法，現(xiàn)報道如下：

1 儀器與試藥

儀器：Agilent 7980氣相色譜儀，HP7694頂空進樣器，氫離子火焰（FID）檢測器，賽多利斯BT125D電子天平。

樣品：雙氫青蒿素磷酸哌喹片（浙江華立南湖制藥有限公司，批號：100923、080710、140710、100813、110710、210610）。試劑：純化水、正丙醇、無水乙醇均為色譜級。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：DB-624（6%腈丙基苯基-94%二甲基硅氧烷，30 m×0.53 μm×3.0 μm）；氮氣為載氣；柱溫：恒溫 80 °C，保持10 min；流速：3.0 ml/min；分流比：10∶1；進樣口溫度：220℃；檢測器溫度：220℃；進樣量：0.1 μl；頂空瓶平衡溫度：80℃，保持30 min；定量環(huán)溫度110℃；傳輸管溫度：120℃；頂空瓶充壓時間：0.5 min；壓力：20 psi（1 psi=6.895 kPa）；定量環(huán)平衡時間：0.15 min；定量環(huán)取樣時間：0.15 min；進樣時間：1.0 min。采用頂空自動進樣方式。

2.2 樣品的制備

內標液的選擇及制備：正丙醇與乙醇為同系物，故選擇正丙醇為內標，取0.02 ml正丙醇于100 ml容量瓶中，精密稱定，并用純化水稀釋至刻度，搖勻作為內標液。

對照品貯備液的制備：取乙醇0.7 ml（約0.5 g）于100 ml容量瓶，精密稱定，并用純化水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。

對照品溶液的制備：制備對照品溶液中乙醇含量與樣品中乙醇含量相當，取對照品貯備液1.0 ml置25 ml容量瓶中，純化水稀釋至刻度，取100.0 μl與內標液2.0 ml置于頂空瓶中，搖勻，加蓋密封，作為對照品溶液。

樣品的制備：雙氫青蒿素磷酸哌喹片碾細，稱取粉末約200 mg置于頂空瓶中，精密稱定，加入內標液2.0 ml，搖勻，加蓋密封，作為樣品溶液。

空白溶劑的制備：取2.0 ml純化水置頂空瓶中，加蓋密封。

2.3 專一性選擇試驗

空白溶劑應對測定無干擾，乙醇峰與正丙醇峰分離度應大于2.0。理論塔板數(shù)按正丙醇峰計，不低于10000。空白溶劑、對照品貯備液、內標液、對照品溶液及樣品色譜圖分別見圖 1～5。

結果顯示，對照品中乙醇峰保留時間為3.356 min，正丙醇峰保留時間為4.505 min；正丙醇峰理論塔板數(shù)為43520，乙醇峰理論塔板數(shù)為63391；分離度為16.22。樣品溶液重復進樣6次，乙醇峰相對保留時間RSD為0.079%，正丙醇峰相對保留時間RSD為0.069%。樣品中乙醇峰保留時間為3.358 min，正丙醇峰保留時間為4.506 min；正丙醇峰理論塔板數(shù)為43549，乙醇峰理論塔板數(shù)為63439；分離度為16.40。樣品溶液重復進樣6次，乙醇峰相對保留時間RSD為0.079%，正丙醇峰相對保留時間RSD為0.069%。

2.4 檢測限與定量限試驗

定量限：測試樣品中乙醇含量能被定量測定的最低值。測試方法為用純化水稀釋對照品溶液，使信噪比達到約10∶1。

檢測限：測試樣品中乙醇含量能被檢測到的最低值。用純化水稀釋對照品溶液，使信噪比達到約3∶1。定量限樣品重復進樣6次，計算RSD。要求RSD小于25%。結果顯示，檢測限=0.19 μg（S/N=3.27）；定量限=0.57 μg（S/N=10.54）。 定量限重復進樣6次，RSD為17%。

2.5 線性關系考察

制備一系列濃度對照品溶液（相當于樣品中乙醇含量在25%～500%），測定該范圍內線性關系，要求r大于0.9900，回歸線截距相對于100%樣品中乙醇含量小于15%。測試方法為將對照品貯備液稀釋10倍（稀釋后約含乙醇0.5 mg/ml），取已稀釋好的對照品貯備液 200.0、100.0、40.0、20.0、10.0 μl到頂空瓶中，分別加入內標液2.0 ml，加蓋密封。制成系列濃度的對照品溶液測定。以乙醇含量為橫坐標，乙醇峰面積與正丙醇峰面積之比為縱坐標，作圖。結果顯示，乙醇含量在5.49～109.80 μg范圍內，線性關系良好?；貧w方程為Y=0.002X+0.003，r=0.9999。截距相對于100%樣品中乙醇含量為6.39%。

2.6 準確度試驗

圖1 空白溶劑色譜圖

圖2 對照品貯備液色譜圖

圖3 內標液色譜圖

圖4 對照品溶液色譜圖

圖5 樣品色譜圖

采用加樣回收的方法測定。要求回收率在90%～110%范圍內，RSD小于5%。用已測得溶劑殘留量的雙氫青蒿素磷酸哌喹片作為乙醇加樣回收的試樣，稱取雙氫青蒿素磷酸哌喹片粉末約200 mg 9份，對照品貯備液稀釋10倍（稀釋后約含乙醇0.5 mg/ml），分別加入稀釋過的對照品貯備液100.0、40.0、20.0 μl（加入的乙醇量相當于樣品中含有乙醇量的250%、100%、50%），每個濃度配制3份樣品。每份樣品進樣2次。結果：250%、100%、50%三個水平的回收率依次為94.87%、95.84%、96.19%，平均回收率為95.63%，RSD=3.32%。

2.7 精密度試驗

重復性測試方法：對照品溶液重復進樣9次。以乙醇峰面積與正丙醇峰面積之比計算RSD。要求RSD小于5%。結果顯示，9次測試的RSD為1.73%。

分析重現(xiàn)性測試方法：精密稱取雙氫青蒿素磷酸哌喹片粉末160、200、240 mg各3份到頂空瓶中，分別加入2.0 ml內標，制成3個濃度9份樣品。以乙醇峰面積與正丙醇峰面積之比計算RSD。要求RSD小于5%。結果顯示，9次測試的RSD為3.26%。

2.8 穩(wěn)定性試驗

測定方法為對照品溶液，樣品第一天測定后室溫（約25℃）放置24 h重復測定。對照品溶液和樣品各測試3份，每份分別測試2次，以其測試結果的平均值進行評價。結果顯示，對照品放置一天后，乙醇的含量平均下降為98.43%，樣品平均下降為98.74%。對照品溶液和樣品溶液24 h內基本穩(wěn)定。

2.9 樣品中乙醇含量測定

測試6個批號的雙氫青蒿素磷酸哌喹片中乙醇殘留量，每個樣品稱取2份，每份約200 mg置頂空瓶中，分別加入內標液2.0 ml，搖勻，加蓋密封，作為樣品。每份樣品進樣測試 2次。 結果顯示， 批號 080710、140710、100813、110710、210610、100923依次測得乙醇殘留為0.01066%、0.01185%、0.01211%、0.00919%、0.00832%、0.01077%。6個批號乙醇殘留量平均值為0.01050%。符合《中國藥典》2010年版附錄溶劑殘留要求及ICH指導原則的要求（乙醇殘留限度為0.5%）。

3 討論

本文建立了一種采用頂空氣相色譜法測定雙氫青蒿素磷酸哌片中殘留乙醇的方法。該方法簡單、快捷、靈敏度高、精確。筆者對樣品的配制濃度、對照品的配制濃度、內標液的選擇、內標液濃度的配制、色譜柱類型的選擇、柱溫、頂空瓶平衡溫度、頂空瓶平衡時間、載氣流速、分流比、檢測器溫度、進樣口溫度都進行了摸索，選擇了最佳的分析方法，并對該分析方法進行了驗證。實驗證明，采用頂空自動進樣測定雙氫青蒿素磷酸哌喹中的乙醇殘留靈敏度高，重現(xiàn)性好，定量準確，精密度高，易于操作。對于固體制劑殘留溶劑的測定，值得注意的是，應該選擇好頂空瓶加熱溫度和平衡時間。本研究中試驗了頂空瓶平衡時間20 min，但測試結果不理想（多次試驗回收率達不到要求），故最終選擇了80℃、30 min的條件。固體制劑中的殘留溶劑測定因存在固體粉末，對溶劑在頂空瓶中的平衡過程會有一定影響，故應該讓固體基質在頂空瓶中充分達到氣-液-固三相平衡后再進樣，以防止固體粉末基質對試驗的影響。

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