三氧化二砷對膠原誘導的關節炎大鼠STAT/SOCS信號轉導通路的影響①

張明峰 周守勤 劉淑霞 彭晨星 郭惠芳 (河北醫科大學第二醫院免疫風濕科,石家莊050000)

類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種高度致殘性疾病。采取有效措施控制滑膜組織增生是改善預后,延長患者壽命的關鍵所在。積極探索療效可靠、毒副作用小、經濟適用的緩解病情藥物,也成為了各風濕病學者研究的重點課題之一。三氧化二砷(As2O3)在急性白血病和各類實體瘤的治療中已取得了舉世矚目的成就,并已經應用于臨床[1,2]。但其對風濕性疾病的治療作用仍在探索之中。前期體外細胞培養研究顯示,As2O3可通過抑制信號轉導及轉錄活化因子(Signal transducer and activator of transcription,STAT)1信號轉導通路,抑制高遷移率族蛋白1誘導的滑膜細胞增殖[3]。本研究借助膠原誘導的關節炎(Collagen-induced arthritis,CIA)大鼠模型進行動物實驗,進一步探討As2O3對滑膜增殖的抑制作用,以及對STAT和細胞因子信號傳導抑制蛋白(Suppressor of cytokine signaling,SOCS)信號通路的影響,為將來As2O3應用于臨床提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 As2O3(黑龍江伊達藥業公司生產);兔抗大鼠p-STAT1、p-STAT3單克隆抗體(Cell Signaling公司);SOCS1、SOCS3多克隆抗體、羊抗大鼠FITC-IgG二抗(Santa Cruz);小鼠抗大鼠PCNA單克隆抗體(北京中山生物工程公司),破膜劑(美國eBioscience公司);牛Ⅱ型膠原(美國Sigma公司);弗氏完全佐劑(美國Sigma公司);卡介苗(上海生物制品研究所);免疫組織化學SP試劑盒(生物晶美公司);Epics-XLⅡ型流式細胞儀(Beckman Coulter);光學顯微鏡(日本Olympus)。

1.2 動物模型制備及分組

1.2.1 實驗動物 雄性Wistar大鼠42只,8～12周齡,體重(160±20)克,購于河北醫科大學實驗動物中心,清潔級動物室內養殖,室內定期進行紫外線照射,所用飼料、水及用具均經定期滅菌處理。室溫控制在18～25℃,相對濕度20%～30%。

1.2.2 Ⅱ型膠原乳劑的制備[4]將Ⅱ型膠原溶于0.1 mol/L的醋酸中,在4℃下攪拌充分溶解,濃度為2 mg/ml,置4℃冰箱過夜。再與完全弗氏佐劑等體積混合,冰浴下用玻璃攪拌器勻速攪拌,至充分乳化,即乳化液滴入水中無消散,制成Ⅱ型膠原乳劑。

1.2.3 造模方法及分組 將42只Wistar大鼠隨機分成五組,Ⅰ組為正常對照組6只,Ⅱ～Ⅴ組每組各9只用于造模,Ⅱ組為模型對照組,Ⅲ～Ⅴ組分別為低、中、高劑量As2O3治療組。適應性喂養7天,第8天進行造模。每只大鼠的尾根部及背部多點皮內注射Ⅱ型膠原乳劑0.2ml初次免疫,第21天腹腔注射乳劑0.2 ml作為二次免疫,第22天開始,對Ⅱ～Ⅴ組大鼠進行關節炎指數評分[5],當總評分大于2分時,陸續開始干預治療,每組給藥6只,其余剔除,造模成功率約70%～80%。采用腹腔注射給藥方法,連續28天。Ⅰ、Ⅱ組給予等體積的生理鹽水,Ⅲ組:1.0 mg/(kg?d)As2O3治療,Ⅳ組:2.0 mg/(kg?d)As2O3治療,Ⅴ組:4.0 mg/(kg?d)As2O3治療。腹腔給藥容量均為20 mg/kg。

1.3 關節標本采集及制作 第50天股動脈取血處死所有大鼠,完整剝離滑膜組織,一并取后肢踝、趾關節,充分剃去皮毛及肌腱組織,浸泡于4%的多聚甲醛中固定48小時后,浸于20%EDTA脫鈣液中,室溫脫鈣,時間3～4周。由踝關節中間縱行剖開,一半用于流式細胞學檢測,一半用于免疫組織化學檢測。后者和滑膜組織(固定24小時)標本均按常規程序,脫水、透明、石蠟包埋,切片 4μm,貼于經多聚賴氨酸處理過的載玻片上,60℃烤片,48小時備用。

1.4 免疫組織化學檢測關節組織中PCNA蛋白的表達 切片厚4μm,常規脫蠟水化,一抗為小鼠抗大鼠PCNA抗體(1∶100稀釋),二抗分別為與一抗相對應的生物素化IgG(1∶100稀釋),以PBS代替一抗作為陰性對照,DAB顯色,光鏡觀察陽性信號。具體步驟按照說明書進行。

1.5 流式細胞術檢測關節組織中PCNA、p-STAT 1/3、SOCS1/3蛋白的表達 將標本用網搓法制成單細胞懸液,取單細胞懸液 1×106ml-1,加入破膜劑,輕微震蕩,孵育15分鐘,離心棄上清;分別加入PCNA、p-STAT1/3、SOCS1/3抗體 100 μl(PCNA 抗體 1∶100稀釋,p-STAT1/3、SOCS1/3抗體為 1∶50稀釋),室溫孵育30分鐘,PBS洗滌后加入1∶50羊抗大鼠FITCIgG二抗工作液100μl,避光室溫孵育30分鐘,PBS洗滌后,在Epics-XLⅡ型流式細胞儀進行檢測。設PBS代替一抗和二抗的陰性對照,以及只加一抗或二抗的陽性對照和同型對照。以熒光指數(FI)表示待測蛋白的相對含量,公式:FI=(樣品蛋白表達的平均熒光強度-對照樣品平均熒光強度)/正常對照樣品平均熒光強度。

1.6 結果判定及統計學處理 免疫組織化學結果判定標準:PCNA蛋白陽性信號表達于細胞核內,呈棕黃色顆粒者為陽性。計量資料以±s表示,采用SPSS11.5統計軟件進行 t檢驗、單因素方差(One-Way ANOVA)分析及Spearman相關分析,P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 As2O3對大鼠關節炎的治療作用 與模型組相比,低、中、高劑量As2O3組關節炎指數呈劑量依賴性下降(P＜0.01),分別為8.75±1.25、6.19±1.27、3.86±0.44和3.23±0.51;中、高劑量顯著優于低劑量組(P＜0.01),見圖1。

2.2 As2O3對關節組織PCNA蛋白表達的影響 免疫組織化學顯示:正常對照組,滑膜襯里層散在滑膜細胞的胞核內可見棕黃色陽性顆粒,軟骨細胞、血管內皮細胞均呈陰性表達;模型組可見大量PCNA蛋白表達陽性的滑膜細胞覆蓋于軟骨表面,并向軟骨下侵蝕,浸潤的炎細胞胞核內可見棕黃色顆粒,少數受損的軟骨細胞內可見淡黃色陽性顆粒。隨著As2O3治療劑量的增加PCNA蛋白陽性的細胞數目明顯減少(圖2)。

流式細胞術結果顯示:模型組PCNA蛋白表達顯著增加,與正常對照組相比差異均具有統計學意義(P＜0.01);As2O3治療后,CIA大鼠關節組織中PCNA蛋白表達顯著下降,接近正常水平(P＜0.01,表1)。

2.3 As2O3對關節組織p-STAT1蛋白表達的影響 模型組關節組織中p-STAT1表達顯著高于正常對照組(P＜0.01);低、中劑量As2O3治療4周,p-STAT1蛋白表達較模型組明顯下降(P＜0.01和 P＜0.05),但仍高于正常對照組(圖3、表1)。

圖1 As2O3對CIA大鼠關節炎指數的影響Fig.1 The effect of As2O3 on MAI of CIA rats in different dose groug

圖2 As2O3對 CIA大鼠滑膜組織中PCNA蛋白表達的影響(IHC,×400)Fig.2 The expression of PCNA protein in the synovium detected by IHC(×400)

圖3 FCM檢測AS2O3對滑膜組織中p-STAT1蛋白的表達的影響Fig.3 Histogram of p-STAT1 protein expression in the synovium detected by FCM

表1 As2O3對 CIA大鼠關節組織中PCNA、p-STAT1/SOCS1,p-STAT3/SOCS3蛋白表達的影響(±s,n=6)Tab.1 The effect of As2O3 on theexpression of PCNA,p-STAT1/SOCS1,p-STAT3/SOCS3 proteins of CIA rats articular tissues by FCM( ±s,n=6)

表1 As2O3對 CIA大鼠關節組織中PCNA、p-STAT1/SOCS1,p-STAT3/SOCS3蛋白表達的影響(±s,n=6)Tab.1 The effect of As2O3 on theexpression of PCNA,p-STAT1/SOCS1,p-STAT3/SOCS3 proteins of CIA rats articular tissues by FCM( ±s,n=6)

Note:One-Way ANOVA,1)P＜0.05,2)P＜0.01 vs normal control group;3)P＜0.05,4)P＜0.01 vsmodel control group.

Group PCNA p-STAT1 SOCS1 p-STAT3 SOCS3 Normal control 1.00±0.16 1.00±0.09 1.00±0.08 1.00±0.08 1.00±0.18 Model control 1.26±0.032) 1.27±0.082) 1.18±0.052) 1.27±0.112) 1.24±0.072)As2O3 treated group Low-dose group 1.10±0.104) 1.06±0.084) 1.12±0.031)3) 1.16±0.022)3) 1.18±0.041)Mid-dose group 0.99±0.054) 1.15±0.062)3) 1.17±0.112) 1.19±0.052) 1.21±0.08 High-dose group 1.04±0.094) 1.33±0.122) 1.23±0.102) 1.23±0.092) 1.20±0.111)

圖4 FCM檢測AS2O3對滑膜組織中SOCS1蛋白的表達的影響Fig.4 Histogram of SOCS1 protein expression in the synovium detected by FCM

2.4 As2O3對關節組織SOCS1蛋白表達的影響 模型組關節組織中SOCS1表達顯著高于正常對照組(P＜0.01);與模型組相比,低劑量組SOCS1蛋白表達減少(P＜0.05),而劑量達 4 mg/(kg?d)后,SOCS1蛋白表達增加,但無統計學意義(圖4、表1)。

圖5 FCM檢測AS2O3對滑膜組織中p-STAT3蛋白的表達的影響Fig.5 Histogram of p-STAT3 protein expression in thesynovium detected by FCM

2.5 As2O3對關節組織p-STAT3蛋白表達的影響 模型組關節組織中p-STAT3表達顯著高于正常對照組(P＜0.01);低劑量As2O3治療4周,p-STAT3蛋白表達較模型組下降(P＜0.05),但仍高于正常對照組,而中、高劑量組蛋白表達變化與模型組相比差異無統計學意義(圖5、表1)。

2.6 As2O3對關節組織SOCS3蛋白表達的影響 模型組關節組織中SOCS3表達顯著高于正常對照組(P＜0.01);不同劑量As2O3治療組中,SOCS3蛋白表達量較模型組下降,但均無統計學意義(圖6、表1)。

圖6 FCM檢測AS2O3對滑膜組織中SOCS3蛋白的表達的影響Fig.6 Histogram of SOCS3 protein expression in the synovium detected by FCM

2.7 相關性分析 低As2O3治療CIA大鼠4周時,p-STAT1/3蛋白表達與PCNA表達成正相關,(r=0.413,P=0.045;r=0.427,P=0.023);高劑量治療4周時,p-STAT1/3蛋白表達與PCNA表達無相關性,(r=0.252,P=0.179,r=0.313,P=0.116)。

3 討論

CIA大鼠是目前研究RA發病機制運用較多的動物模型。本實驗采用Wistar大鼠,通過牛Ⅱ型膠原聯合弗氏完全佐劑誘發免疫反應,成功誘導了CIA動物模型,造模成功率在70%以上。基于白血病和腫瘤性疾病的研究成果,近年來,部分風濕病學者以As2O3治療實驗性關節炎[6,7],結果顯示As2O3可以通過抑制滑膜細胞分化,誘導滑膜細胞凋亡,但As2O3的作用機制尚不清楚。

本實驗首先應用免疫組織化學和流式細胞術兩種方法,從定位和半定量的角度探討了反映細胞增殖的標記物——增殖細胞核抗原(PCNA)的表達情況,模型組大鼠關節軟骨表面、軟骨下骨組織內均可見大量PCNA蛋白表達陽性的滑膜細胞浸潤,同時炎細胞增生也顯著增加,提示模型組大鼠滑膜組織已經出現高度侵蝕性增生。As2O3治療后,PCNA蛋白在浸潤的炎細胞、滑膜細胞中的表達均下降,說明As2O3能夠顯著抑制包括滑膜細胞在內的多種細胞的增殖。

STAT是一種能與靶基因調控區DNA結合的胞質蛋白家族,在人和哺乳動物中已發現7個STAT家族成員 :STAT 1 ～4 、STAT 5a、STAT 5b、STAT 6,能夠介導多種細胞因子調控的細胞生長、分化、增殖及凋亡過程[8]。STATs作為轉錄因子在沒有特異性的刺激時定位于胞質內,當細胞受到刺激時,STATs上的SH2結構域與細胞膜受體中被磷酸化的酪氨酸殘基結合,同時自身發生磷酸化并迅速形成同源或異源二聚體,轉運至細胞核內,與啟動子結合,調節基因轉錄,完成細胞因子受體介導的信號轉導,調節機體的天然免疫及獲得性免疫應答反應。目前已知,STAT1和STAT3與RA滑膜炎嚴重程度密切相關。本研究結果也顯示,模型組關節組織中p-STAT1/3表達顯著增高,低劑量As2O3治療4周,p-STAT1/3蛋白表達較模型組明顯下降,并與PCNA表達呈正相關,而高劑量組其表達量有增加趨勢,說明低劑量具有抑制滑膜細胞增殖的作用,而高劑量可能具有促進增殖的作用。既往研究也顯示,4.0 mg/kg/d和6.0 mg/kg/d的As2O3治療CIA大鼠兩周,電鏡下觀察發現,關節A型滑膜細胞減少,B型滑膜細胞增加[9]。因此,As2O3治療劑量和療程的選擇尚需進一步探討。

細胞因子信號傳導抑制蛋白(Suppressor of cytokine signaling,SOCS)家族是一類由細胞因子誘導產生并反饋性阻斷細胞因子信號轉導過程的負性調節因子,參與多種細胞因子、生長因子和激素的信號調節,對于維持機體內環境穩定起著重要的內源性調節作用[10,11]。SOCS通過與STAT競爭性結合細胞因子受體的酪氨酸磷酸化位點,對Janus激酶/STAT信號通路進行負反饋調節,減少多種細胞因子受體的表達而抑制細胞因子介導的信號傳遞。SOCS1是最早被發現的SOCS家族成員之一,SOCS1是STAT1的特異性內源性抑制劑。本研究發現,模型組p-STAT1的活性增強反饋性引起SOCS1表達增強,低劑量As2O3干預治療后,p-STAT1表達減少,其反饋性調節作用減弱,SOCS1表達量相對減少;但是當高劑量治療時,隨著p-STAT1表達增加,再次激發SOCS1表達增加,推測低劑量As2O3可能通過干預p-STAT1/SOCS1信號通路抑制滑膜組織的增殖。SOCS3是STAT3的負性調節子。本實驗中,模型組p-STAT3的活性增強也反饋性引起了SOCS3表達增強,低劑量As2O3干預治療后,隨著p-STAT3表達減少,SOCS3表達量也相對減少,但尚無統計學意義。由此看來,As2O3是否對p-STAT3/SOCS3信號通路有顯著抑制作用尚需擴大樣本量進一步研究。

綜上所述,As2O3是抑制滑膜細胞增殖的良好藥物,該藥可通過調控p-STAT1信號通路抑制關節炎進展。但是,As2O3畢竟是一種劇毒物質,具有治癌和致癌雙向作用。RA發病機制非常復雜,有多種細胞共同參與滑膜組織的增殖過程,As2O3在低劑量時具有抑制增殖的作用,高劑量可能具有促進細胞轉化和原漿毒作用[12],因此,治療時間和劑量的積累對于產生毒副作用都至關重要。如何在保證療效的前提下,最大限度的降低毒副作用尚需深入探討。是否可以通過改變給藥方式,減輕體內蓄積產生的毒副作用,亦有待進一步研究。

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