牛卵泡抑素基因克隆及真核表達載體構建

康 峰,蘇廣華,蘇建國,段 彪,王子東,李光鵬＊

(1.內蒙古大學生殖生物學及生物技術教育部重點實驗室,內蒙古呼和浩特 010021;2.西北農林科技大學動物科技學院,陜西楊凌 712100)

引言

卵泡抑素(Follistatin,FSTN)又名FSH抑制蛋白(FSH-suppressing protein,FSP),是一種單鏈糖蛋白。人FSTN的基因長約為6 kb,含有6個外顯子(exon)和5個內含子(intron),mRNA長1 kb左右[1]。FSTN最初是從牛[2]和豬[3]的卵泡液中分離出來的,但是后來發現FSTN的mRNA在多種組織和器官中都有表達,例如卵巢、睪丸、垂體、腎上腺、腦皮質 、骨髓 、心臟 、肺 、胸腺 、骨骼肌 、腎 、胰等,其中卵巢中的表達量最高[4]。

近年來的實驗表明,FSTN以旁分泌或自分泌的方式,與轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)超家族的許多成員,如骨形態發生蛋白(bone morphogenic protein,BMP)、肌肉抑素(myostatin,MSTN)等結合,在生殖系統以外的器官和組織中起重要作用[5],如肝、腎、胰、骨骼肌、皮膚等,這表明FSTN對不同類型的細胞有廣泛的調節作用[6]。

MSTN是目前所知的最強的骨骼肌生長抑制物[7]。人們試圖尋找MSTN的抑制物,達到促進肌肉生長的目的。有研究表明,FSTN能抑制MSTN的活性[8],FSTN蛋白能夠同MSTN黏合在一起,阻斷其抑制功能,促進肌肉的生長[9]。FSTN今后可能會用于治療人類肌肉性疾病,以及提高家畜肌肉的質量和數量。本研究構建了FSTN的過表達載體,為培育肌肉發達的轉基因肉牛新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 引物設計

根據GenBank中牛的FSTN mRNA序列(GenBank注冊號:NM 175801.2),用 Primer Premier 5.0軟件設計用于擴增FSTN編碼區完整序列的引物 P1(5'-AACTGGAAT TCTGCCCTCAGGATGGCCCGT-3')和P2(5'-AACTGCTGCAGTGAACAT TGGTGGAGGGT-3'),以及用于質粒檢測的引物P3(5'-ACAAGACAGAACTGAGCAAGG-3')和P4(5'-GGACAGAAAACATCCCGAC-3')。

1.2 牛FSTN基因的PCR擴增、T載體連接、陽性克隆篩選及測序

從屠宰場獲得剛屠宰肉牛的卵巢,立即放入液氮罐中帶回實驗室,用Trizol法提取總RNA。用六堿基隨機引物(Promega)和SuperscriptⅢ反轉錄酶(Invitrogen)進行反轉錄。用特異性引物P1和P2進行牛FSTN基因的PCR擴增。PCR反應體系為25 μ L,包括 10 ×Reaction buffer 2.5 μ L,MgCl2(25 mM)2.5 μ L,dNTP 1 μ L,引 物各 1 μ L,cDNA 1 μ L,Taq DNA 聚合酶 0.2 μ L(5 U/μ L),去離子水補至25 μ L。PCR反應程序:94℃預變性5 min;94℃變性30 s,59℃退火30 s,72℃延伸1 min,30個循環;72℃10 min;20℃程序結束。切膠回收目的片段(1 085 bp),連入pMD18-T載體,轉化 E.coli DH5α感受態細胞。涂平板37℃過夜,用引物 P3和P4進行克隆PCR,以便獲得陽性克隆(預期擴增長度385 bp)。PCR反應體系為25 μ L。PCR反應程序:94℃預變性5 min;94℃變性30 s,54℃退火30 s,72℃延伸30 s,30個循環;72℃10 min;20℃程序結束。選擇3個陽性克隆進行測序,以便能獲得沒有突變的陽性克隆。

1.3 FSTN過表達載體的構建

對測序正確無誤的一個陽性克隆在添加氨芐青霉素的液體LB培養基中培養16～20 h,提取質粒(pMD18-T-FSTN),測定濃度。將真核表達質粒載體pIRES2-AcGFP1(Clontech)轉化 E.coli DH5α,篩選陽性克隆,在添加卡那霉素的液體LB培養基中培養16～20 h,提取質粒,測定濃度。把pMD18-T-FSTN與pIRES2-AcGFP1同時經EcoRI與PstI雙酶切。膠回收FSTN和pIRES2-AcGFP1骨架片段,用T4連接酶進行連接,轉化E.coli DH5α感受態細胞,涂具有卡那霉素抗性的LB平板,37℃培養過夜,篩選陽性克隆,搖菌,提取質粒,獲得FSTN過表達載體pIRES2-AcGFP1-FSTN(如圖1)。

圖1 過表達載體pIRES2-AcGFP1-FSTN

2 結果

2.1 牛FSTN基因的克隆與鑒定

2.1.1 牛卵泡抑素基因cDNA的克隆與鑒定 牛FSTN基因PCR擴增結果(如圖2),1 085 bp處有明顯條帶,與目的條帶大小一致。檢測引物擴增pMD18-T-FSTN的結果(如圖3)表明,獲得了預期大小片段(375 bp),初步表明T載體中含有牛FSTN序列。測序結果說明擴增的目的片段準確無誤。

圖2 FSTN全長PCR

圖3 PCR檢測引物篩選陽性克隆結果

2.2 過表達載體的PCR檢測

隨機挑取10個克隆進行PCR檢測,1號與7號克隆獲得預期大小片段(如圖4)。

圖4 pIRES2-AcGFP1-FSTN的PCR檢測

2.3 過表達載體的酶切鑒定

選擇2.2中 1、7號菌落擴培,提取質粒后 EcoRI與PstI酶切鑒定,若載體構建正確,可將FSTN切下,產生1 079 bp與5 298 bp兩個片段。電泳酶切產物(如圖5),電泳結果表明質粒構建正確。

圖 5 EcoRI與 PstI雙酶切 pIRES2-AcGFP1-FSTN結果

3 討論

利用基因工程技術治療遺傳性肌肉疾病,包括基因替換[10-13]、外顯子跳躍[14]以及突變抑制[15,16]等手段,這些方法均在早期臨床治療中可以取得一定成效,但是他們都不是長效持久的治療方法[17]。

MSTN對骨骼肌生長具有強烈抑制作用[18],而FSTN蛋白能夠同MSTN黏合在一起,阻斷其抑制功能,促進肌肉的生長[19]。目前,通過抑制MSTN而治療肌肉疾病已成為一種可供選擇的方法[19]。將人FSTN連入腺病毒載體(AAV1)中,將質粒注射到患有杜氏營養不良癥的小鼠四頭肌內,小鼠肌肉增生,且療效持久[20]。之后將AAV1-FSTN注射到患有杜氏營養不良癥的恒河猴四頭肌內,也取得了良好的治療效果[17],這為日后用于治療人類杜氏營養不良癥奠定了基礎。腺病毒載體表達FSTN后可以達到良好治療效果,盡管如此,其病毒自身存在安全問題,因此構建安全的基因過表達載體應成為日后研究重點。本研究構建的FSTN的過表達載體為這方面作出了努力,在日后工作中需要繼續驗證其表達穩定性及安全性,以期在治療肌肉疾病方面做出貢獻。

比利時蘭牛和皮埃蒙特牛具有的雙肌現象(骨胳肌過度發育)都是由于MSTN單個位點發生突變導致該基因失活的結果,MSTN基因敲除小鼠的肩和臀部肌肉明顯肥大,整體骨骼肌明顯高于野生型鼠,某些肌肉的重量約為野生型鼠的2～3倍[18]。FSTN轉基因小鼠肌肉數量遠高出野生型同窩出生仔鼠,尤其胸大肌、三頭肌、四頭肌和臀肌較為發達[21]。在小鼠體內的研究表明FSTN轉基因有望成為培育肌肉發達的轉基因肉牛新品種的手段之一。將構建的FSTN的過表達載體轉入牛胎兒成纖維細胞,篩選并建立轉基因細胞系,通過核移植技術生產轉基因牛。

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