懷牛膝藥材的HPLC指紋圖譜研究Δ

趙變，常珍珍，史彪，孫祥德（新鄉醫學院藥學院，新鄉市453003）

四大懷藥包括牛膝、地黃、山藥、菊花，是著名的河南道地藥材，產于焦作。其中，牛膝為莧科植物牛膝Achyranthes bidentataBl.的干燥根，味苦、甘，性平，歸肝、腎經。能補肝腎、強筋骨、逐瘀通經、引血下行，用于治療腰膝酸痛、筋骨無力、肝陽眩暈[1]等證。2010年版《中國藥典》（一部）中將牛膝類藥材分為牛膝和川牛膝2種收錄。現代中藥化學和藥理學研究表明，牛膝中含有皂苷類[2]、植物甾酮類[3]、糖類[4]、黃酮類等化學成分。人們對牛膝的藥理、毒理及其化學成分等方面的研究逐漸深入，但尚缺少綜合評價藥材品質的方法和標準。目前，通過建立指紋圖譜來控制中藥的質量已成為越來越多人的共識[5]，但有關懷牛膝的指紋圖譜研究少見報道，僅有的文獻方法[6]存在組分峰相對較小、分離度不高、未經相似度評價等不足。因此，本試驗采用高效液相色譜（HPLC）法建立了懷牛膝原藥材和經硫磺熏制過的懷牛膝藥材的指紋圖譜，并進行了相似度比較，以期為該藥材的全面質量控制提供依據。

1 儀器與試藥

SHIMADZU LC-6AD型HPLC儀、SPD-20A型紫外檢測器（日本島津公司）；FA2004型分析天平（上海良品儀器有限公司）；超聲波清洗器（工作頻率：59 kHz，功率：45 W，上海科導超聲儀器有限公司）。

甲醇（色譜純，天津賽孚瑞科技有限公司）；冰醋酸（分析純，天津市德恩化學試劑有限公司）；5-羥甲基糠醛標準品（批號：A0298，純度＞99%）、蛻皮甾酮標準品（批號：A0217，純度＞99%）均購自成都曼思特生物科技有限公司；試驗所用原藥材和熏制藥材均購自河南道地產區GAP示范基地，并經新鄉醫學院藥學院中藥學教研室荊云副教授鑒定為真品（藥材來源見表1），將藥材粉碎，過二號篩，置廣口瓶中密塞備用[硫磺熏制方法：將藥農初加工后牛膝放入缸內，反復沖水洗凈泥土，放入牛膝焙中，點燃硫磺鍋，用草苔覆蓋，按每100 kg牛膝用硫磺2 kg熏制8 h；然后用大鍋將水溫成100℃，把牛膝帶莖端（莖下3 cm）用水沖洗1 min后悶放2 h，再沖清水，放入牛膝焙中，按每100 kg牛膝用硫磺1 kg熏蒸6 h]。

表1 藥材來源Tab 1 The origin of medicinal samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：SHIMADZU shim-pack VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-0.1%醋酸水溶液（B），梯度洗脫（0 min：A∶B＝0∶100；45 min：A∶B＝45∶55；55～65 min：A∶B＝70∶30）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：279 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 標準品溶液的制備

取蛻皮甾酮標準品10 mg，精密稱定，以甲醇溶解并稀釋制成每1 mL中含1.0 mg的蛻皮甾酮標準品貯備液，備用。取5-羥甲基糠醛標準品11 mg，精密稱定，以甲醇溶解并稀釋制成每1 mL中含1.0 mg的5-羥甲基糠醛標準品貯備液，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取懷牛膝樣品粉末（過四號篩）2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，稱重，超聲提取1 h，冷卻后補足重量，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 對照試驗 分別精密吸取標準品溶液和供試品溶液各20 μL，注入HPLC儀，記錄80 min內的色譜峰。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4.2 精密度試驗 取一新制備的供試品溶液適量，在上述色譜條件下連續進樣5次，記錄指紋圖譜。結果表明，各色譜峰相對峰面積和相對保留時間基本一致。對測定結果以相似度軟件進行計算，可得相似度分別為0.990、0.992、0.994、0.985、0.991，均＞0.98，RSD＝0.34%（n＝5），表明本方法精密度較好，符合指紋圖譜技術要求。

2.4.3 穩定性試驗 取一新制備的供試品溶液適量，在上述色譜條件下分別于0、2、4、6、12、24、48 h進樣，記錄指紋圖譜。結果表明，各色譜峰相對峰面積和相對保留時間基本一致。對測定結果以相似度軟件進行計算，可得相似度分別為0.989、0.991、0.994、0.990、0.986、0.992、0.994，均＞0.98，RSD＝0.29%（n＝7），表明供試品溶液在48 h內穩定。

2.4.4 重復性試驗 取同一批藥材適量，共6份，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣測定，記錄指紋圖譜。結果表明，各色譜峰相對峰面積和相對保留時間基本一致。對測定結果以相似度軟件進行計算，可得相似度分別為 0.974、0.984、0.999、0.997、0.998、0.985，RSD＝1.02%（n＝6），表明本方法重復性較好。

2.5 懷牛膝藥材指紋圖譜的建立[7]

2.5.1 懷牛膝原藥材指紋圖譜的建立 取12批懷牛膝原藥材供試品溶液各20 μL分別進樣，所得HPLC圖譜以AIA格式導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）”軟件，得到12批懷牛膝原藥材的HPLC指紋圖譜疊加圖，詳見圖2A。

2.5.2 經硫磺熏制過的懷牛膝藥材指紋圖譜的建立 按“2.5.1”項下方法處理11批經硫磺熏制過的懷牛膝樣品，得到經硫磺熏制過的懷牛膝藥材的HPLC指紋圖譜疊加圖，詳見圖2B。

圖2 HPLC指紋圖譜疊加圖Fig 2 HPLC fingerprints

2.5.3 相似度分析 運用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）”軟件將各藥材的指紋圖譜進行數據處理，生成指紋圖譜的共有模式即為對照圖譜，計算各樣品圖譜與對照圖譜的相似度。12批懷牛膝藥材與11批經硫磺熏制過的懷牛膝藥材的相似度見表2。以蛻皮甾酮峰為內參比峰，計算各共有峰與內參比峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表3～表6。

表2 12批懷牛膝藥材和11批經硫磺熏制過的懷牛膝藥材的相似度Tab 2 Similarities of 12 batches ofA.bientata and 11 batches ofA.bientata fumigated by sulphur

表3 12批懷牛膝原藥材樣品指紋圖譜共有峰相對保留時間Tab 3 Relative retention time of the common peaks of fingerprints of 12 batches ofA.bientata

3 討論

本試驗建立了懷牛膝藥材的HPLC指紋圖譜，并首次建立了經硫磺熏制過的懷牛膝的指紋圖譜，為懷牛膝藥材的質量控制提供了新的依據。原藥材中標定了24個共有峰，通過標準品對照指認了2個色譜峰，其中9號峰為5-羥甲基糠醛，18號峰為蛻皮甾酮（見圖1C）。

運用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）”軟件進行分析，結果表明，12批原藥材中，9批藥材的相似度均在0.9以上，證明懷牛膝藥材的相似度較高，其所含化學成分有較高的相似性；第5、9、10批樣品的相似度在0.9以下，這可能是由于土壤環境（如砂土、爐土、混合土等不同土質）以及不同農戶施肥情況不同，導致其部分成分的含量有差異。

表4 12批懷牛膝原藥材樣品指紋圖譜共有峰相對峰面積Tab 4 Relative peak areas of the common peaks of fingerprints of 12 batches ofA.bientata

為了便于保存，且使其色澤好看，藥商常將收購的中藥飲片或原藥材進行硫磺熏制處理。用硫磺熏制過的中藥或多或少地含有硫磺化合物，這不僅不衛生，還可能對人體有毒害[8]。試驗表明，懷牛膝原藥材和經硫磺熏制過的藥材有很大差異：在相同的試驗條件下，經硫磺熏制過的樣品不僅整體出峰較高，而且在前30 min內組分色譜峰數目明顯增多，說明懷牛膝藥材經硫磺熏制以后不僅化學成分的量發生了改變，而且在硫磺的作用下原有組分發生了化學作用，產生了新的物質。如，原藥材圖譜中8～13號之間的峰對應硫磺熏制藥材中7～11號之間的峰，可見硫磺熏制藥材的峰明顯增高。相似度結果也表明，11批經硫磺熏制過的懷牛膝藥材的整體相似度下降，其中有4批相似度在0.8以下，說明藥材經硫磺熏制后其組分的種類和量的變化程度不一，難以控制。11批硫磺熏制藥材中標定了20個共有峰，其中被指認出的5-羥甲基糠醛峰在硫磺熏制后增加尤其明顯。5-羥甲基糠醛會對人的橫紋肌造成一定的傷害，《中國藥典》對部分中藥材中5-羥甲基糠醛有含量限度規定，所以在對懷牛膝進行質量標準的完善時亦應增加對5-羥甲基糠醛含量的限量標準，以確保藥材的質量符合臨床用藥要求。

表5 11批經硫磺熏制過的樣品指紋圖譜共有峰相對保留時間Tab 5 Relative retention time of the common peaks of fingerprints of 11 batches ofA.bientata fumigated by sulphur

試驗比較了回流、索氏、超聲3種樣品提取方法，結果表明，3種方法的提取效果接近，因此選用操作更為簡便、省時的超聲提取法。再對不同提取時間（30、60、120 min）、不同醇濃度（50%甲醇、80%甲醇、100%甲醇、95%乙醇、50%乙醇、正丁醇）進行了比較，最終確定以50%甲醇超聲60 min作為供試品溶液的制備方法，所得色譜峰峰數多、峰面積大、整體基線好。

表6 11批經硫磺熏制過的樣品指紋圖譜共有峰相對峰面積Tab 6 Relative peak areas of the common peaks of fingerprints of 11 batches ofA.bientata fumigated by sulphur

在200～400 nm波長范圍內對供試品溶液進行掃描后，選擇出峰較好的220、230、245、279 nm等波長條件進行比較。結果發現，在279 nm波長處檢測不但出峰最多，且整體信號較強，因此選擇279 nm為檢測波長。

試驗考察了甲醇-水、甲醇-0.1%醋酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%醋酸水溶液等不同的流動相系統。結果表明，以甲醇-0.1%醋酸水溶液作流動相時色譜峰的基線平穩、峰形及分離度都較好，故選其作為流動相。

隨著溫度的提高，各峰的保留時間會前移，但對峰數和分離度影響不大。綜合各因素，選擇30℃為柱溫條件。

在本文建立的色譜條件下，所建指紋圖譜較文獻方法[6]出峰多，且共有峰也較多，可為懷牛膝的全面質量控制提供更可靠的參考依據。

[1] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：67、35.

[2] 衛修來，高昌琨，高 建，等.懷牛膝總皂苷含量測定[J].安徽醫藥，2007，11（5）：424.

[3] 孟大利.中藥牛膝中的植物甾酮類成分[J].沈陽藥科大學學報，2006，23（9）：562.

[4] 時春娟，周永達，張劍波，等.牛膝多糖研究進展[J].中國新藥雜志，2006，15（16）：1 330.

[5] 劉 靜，周曉梅，祝與鳴，等.中藥質量控制方法研究進展[J].中國藥房，2010，21（3）：281.

[6] 鄭曉珂，董三麗，馮衛生，等.懷牛膝HPLC指紋圖譜研究[J].中國實驗方劑學雜志，2004，4（10）：6.

[7] 張志斐，肖 蓉，袁志芳，等.河北道地藥材知母HPLCELSD指紋圖譜研究[J].藥物分析雜志，2006，26（11）：1 569.

[8] 湯麗清.當前中藥炮制存在的問題和解決對策[J].湖南中醫藥導報，2002，8（11）：697.