HPLC 法同時測定復合維生素口服液中4種水溶性維生素的含量

白靖，向柏，申磊，何朝星，張貴琴，曹德英（河北醫科大學藥學院，石家莊市050017）

維生素是維持人體健康所必需的營養元素[1]，有利于促進和平衡體內組織的新陳代謝，被廣泛用于臨床治療、輔助治療及日常營養、保健。目前，復方維生素類制劑占據了相當大的市場，因此關于維生素測定方法的研究越來越值得關注。液質聯用技術[2]的引入，將色譜的分離能力與質譜的定性功能相結合，提高了微量元素的檢測靈敏度和精準度，然而此方法高成本的缺點限制了其普及應用。因此，如何運用常規的維生素測定方法，無論是紫外分光光度法[3]、熒光分光光度法[4]，還是高效液相色譜（HPLC）法[5，6]，簡便、準確、高效地測定多種維生素，已成為復方維生素制劑質量控制研究的重要手段。

復合維生素口服液為河北醫科大學藥劑教研室自制保健產品，旨在將脂溶性維生素與水溶性維生素相結合，其主要成分為維生素A、維生素D3、維生素E、右泛醇、維生素B1、維生素B2磷酸酯鈉、煙酰胺、維生素B6等，可為人體提供全方位的營養支持，用于營養不良及臨床輔助治療。目前關于維生素B1、維生素B2磷酸酯鈉、煙酰胺、維生素B64種水溶性維生素的含量測定方法，大多采用HPLC法，應用流動相梯度洗脫方式[7]，樣品處理煩瑣，測量時間較長，且往往僅限于分析水溶性維生素組成的復方制劑。本研究在摸索復合維生素口服液中多組分維生素含量測定方法時，建立了方便的等度反相HPLC法同時測定制劑中維生素B1、維生素B2磷酸酯鈉、煙酰胺和維生素B6的含量，實現了在脂溶性維生素并存的情況下分析目標水溶性維生素，而且每個樣品進樣前只需用水稀釋，分析時間小于15 min。該法簡便、快速、準確、重復性好，大大縮短了測量時間，有利于生產過程中該類產品的質量控制。

1 儀器與試藥

Lab Alliance Model 500 HPLC儀（美國Lab Alliance公司）；BP211D型電子分析天平（德國Satorius公司）；復合維生素口服液（自制，批號：20100301、20100302、20100303，規格：每支10 mL，含維生素B1100 mg、維生素B2磷酸酯鈉70 mg、煙酰胺350 mg和維生素B630 mg）；己烷磺酸鈉（天津傲然精細化工研究所，批號：20071116，純度：≥99.0%）；煙酰胺、維生素B6、維生素B1和維生素B2磷酸酯鈉（核黃素磷酸鈉）標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為：100115-200302、100116-200502、100390-200502、100283-200501，純度：均大于99.0%）；甲醇為色譜純，冰醋酸為分析純；水為二次純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：己烷磺酸鈉溶液（1 g→690 mL水）-甲醇-冰醋酸（690∶303∶7，V/V/V）；流速：1 mL·min－1；檢測波長：280 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 標準品溶液。精密稱取煙酰胺875 mg、維生素B675 mg、維生素B1250 mg和維生素B2磷酸酯鈉175 mg，同置于250 mL容量瓶中，加水100 mL使溶解，再用水稀釋至刻度，搖勻。精密量取10 mL，置于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為標準品溶液。

2.2.2 供試品溶液。將復合維生素口服液搖勻，精密量取2.5 mL，置于250 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 系統適用性試驗

分別取標準品溶液及供試品溶液各20 μL注入色譜儀，按“2.1”項下色譜條件分析，記錄色譜，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

由圖1可見，在上述色譜條件下，含有脂溶性維生素的復合維生素口服液中的煙酰胺、維生素B6、維生素B1和維生素B2磷酸酯鈉能得到很好的分離。

2.4 線性關系考察

精密稱取標準品煙酰胺875 mg、維生素B675 mg、維生素B1250 mg和維生素B2磷酸酯鈉175 mg置于同一100 mL容量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻。吸取上述溶液0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取上述溶液20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜。以峰面積（A）為縱坐標，濃度（c，μg·mL－1）為橫坐標進行線性回歸，相關結果見表1。

表1 各組分線性關系考察結果Tab 1 Results of linear ranges for 4 kinds of vitamins

表1結果表明，各組分在相應的濃度范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.5 精密度試驗

精密吸取供試品溶液20 μL，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果，煙酰胺、維生素B6、維生素B1和維生素B2磷酸酯鈉峰面積值的RSD分別為0.5%、0.6%、0.6%和0.9%（n＝6），表明精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取本品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液（冷處貯藏），按“2.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、6、8 h進樣，記錄峰面積。結果，煙酰胺、維生素B6、維生素B1和維生素B2磷酸酯鈉峰面積值的RSD分別為0.7%、0.6%、1.2%、1.9%（n＝5），表明溶液在8 h內穩定。

2.7 重復性試驗

精密量取本品，按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，照“2.1”項下色譜條件進樣。結果，煙酰胺、維生素B6、維生素B1和維生素B2磷酸酯鈉峰面積值的RSD分別為0.7%、0.8%、0.7%、1.3%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.8 回收率試驗

分別按處方量的80%、100%、120%精密稱取煙酰胺，按處方比例稱取其他主藥及輔料制備成低、中、高濃度（280、350、420 μg·mL－1）的樣品溶液各3份，按“2.1”項下色譜條件進樣，計算回收率；同法測定維生素B6、維生素B1和維生素B2磷酸酯鈉的回收率。結果煙酰胺、維生素B6、維生素B1和維生素B2磷酸酯鈉的平均回收率分別為101.3%（RSD＝1.7%，n＝9）、99.5%（RSD＝1.5%，n＝9）、100.0%（RSD＝1.9%，n＝9）和98.4%（RSD＝2.0%，n＝9）。

2.9 樣品含量測定

取3批復合維生素口服液，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。取標準品與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，按外標法計算樣品濃度，結果詳見表2。

表2 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 2Results of content determination in samples（n＝3）

3 討論

本試驗在流動相組成考察時，發現在甲醇的基礎上加入少量冰醋酸，指標成分峰形和分離效果有明顯改善；同時發現，離子對試劑己烷磺酸鈉的加入，能有效改善主峰的分離度，且流動相中己烷磺酸鈉溶液與甲醇的比例對主峰分離效果影響較大，最終確定己烷磺酸鈉溶液與甲醇的比例為690∶303（V/V）。本文使用己烷磺酸鈉作離子對試劑，用簡單的等度洗脫方式即可實現對4種水溶性維生素的分離，而且脂溶性維生素組分及輔料對其測定無干擾；整個樣品的分析時間僅為15 min，大大提高了分析效率。同時，試驗證明，樣品進樣前只需用水稀釋，即可滿足指標成分的檢測，既降低了成本，又避免了操作上的煩瑣，有利于實際生產過程中大量產品的分析測定。

考慮到維生素對氧、光、熱、金屬離子敏感[8]，建議本品密封、避光、冷處保存，且供試品溶液制備后盡快分析測定。

本試驗建立的HPLC法能夠同時測定煙酰胺、維生素B6、維生素B1和維生素B2磷酸酯鈉4種維生素成分的含量，且方法簡便、快速、準確、重復性好，為含有上述維生素類成分的多維復方制劑及保健產品的質量控制提供了參考。

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