抗結核特異性轉移因子主要有效成分研究

潘建超* 薛東升 張文明

（上海凱寶藥業股份有限公司，上海 201401）

主要生物分子物質含量測定和分析。

1 脂肪類物質檢測

用高效薄層層析色譜法[1]，對樣品進行分析，然后分別用碘熏蒸法顯色和間苯二酚-鹽酸溶液顯色檢測樣品中中性脂和糖脂含量。

1.1 檢測方法

①層析板預處理：取硅膠G薄層板于130℃活化1h。②層析：取供試品用全自動點樣儀上樣，斑點直徑＜0.5cm，涼干，作4個上樣點，置展開缸中展開。展開劑為氯仿∶甲醇∶0.2%CaCl2（55∶45∶10）。③顯色：每兩個上樣點為一組，取一組硅膠板，用噴瓶噴灑間苯二酚-鹽酸溶液[取間苯二酚2g溶于蒸餾水100mL中，取10mL 2%間苯二酚水溶液加80mL 36%濃鹽酸（含0.25mL 0.1mol/L硫酸銅）加水定容到100mL，使用前4h配制]，噴后即加玻璃片封蓋，110℃顯色20min。取另一組硅膠板，置一個密閉玻璃容器內，加入少量碘，稍微加熱使碘變為碘蒸氣，熏蒸5min。

1.2 測定結果

用薄層色譜分析，樣品在兩組薄層板均無顯色條帶出現，說明樣品中不含中性脂肪類物質和糖脂類物質，而陽性對照品中性脂（大豆卵磷脂）和糖脂（單唾液酸四己糖神經節苷脂）皆出現明顯顯色條帶。

2 糖類物質含量測定

用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法[2]和地衣酚法[3]對樣品進行總糖和核糖含量測定。

2.1 總糖含量測定

①葡萄糖溶液的制備：精密稱取葡萄糖約10.0mg，置10mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，混勻，精密吸取1mL置5mL量瓶中，加水至刻度，即為200μg/mL的葡萄糖溶液，臨用新制。②二硝基水楊酸（DNS）試劑配制：稱取DNS 1g，苯酚0.2g，亞硫酸鈉0.05g，氫氧化鈉1g，酒石酸鉀鈉20g，加水溶解并稀釋至100 mL即得。③樣品溶液：取原液用注射用水稀釋2倍即得。④測定法：取葡萄糖溶液、水和樣品溶液于10mL玻璃試管中，混勻，分別加入3mL的DNS試劑，置沸水浴中加熱15min，放冷，用水稀釋至10mL，搖勻，照分光光度法測定550nm處吸光度。⑤結果計算：用葡萄糖對照品溶液濃度對其相應吸光度作直線回歸（R2應≥0.99），由直線方程求出樣品溶液總糖含量。

2.2 核糖含量測定

①D-核糖溶液的制備：精密稱取D-核糖約10.0mg，置10mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，混勻，從中精密量取1mL，置5mL量瓶中，加水至刻度，即為200μg/mL的D-核糖溶液，臨用新制。②三氯化鐵-鹽酸溶液配制：稱取三氯化鐵（FeCl3·6H2O）0.5g，加濃鹽酸溶解成500mL，即得。③地衣酚試劑：取1g重結晶地衣酚用95%乙醇溶解定容至10mL即得。④樣品溶液：取原液用注射用水稀釋2倍即可。⑤測定法：取D-核糖溶液、水和樣品溶液于10mL玻璃試管中，混勻，分別加入1mL的三氯化鐵-鹽酸溶液，然后再加入0.1mL的地衣酚溶液，置沸水浴中加熱40min，放冷，用水稀釋至5mL，搖勻，照分光光度法測定670nm處吸光度。⑥結果計算：用核糖對照品溶液濃度對其相應吸光度作直線回歸（R2≥0.99），由直線方程求出樣品溶液核糖含量。

2.3 測定結果

結果顯示，葡萄糖溶液和核糖溶液線形關系很好（圖1），R2＞0.99。根據測定結果帶入各自直線方程計算和乘以樣品稀釋倍數，樣品溶液中總糖含量為255.3μg/mL，核糖含量為198.0μg/mL。結果顯示樣品中核糖含量占總糖含量的77.55%，說明樣品糖類物質主要以核糖為主。

圖1 抗結核特異性轉移因子原液糖類物質測定標準曲線和直線方程

3 核酸檢測

用瓊脂糖平板法[4]測定樣品中核酸含量，用紫外掃描分析最大紫外吸收波長。

3.1 測定方法：①瓊脂糖核酸電泳：配制2%瓊脂糖平板，含0.5μg/mL的溴乙錠；取DNA標準和原液樣品，分別點樣10μL進行電泳，電泳后置紫光燈觀察和攝像。②紫外吸收波長掃描：取原液，用注射用水稀釋10倍后于200～400nm進行紫外吸收波長掃描分析。

3.2 結果

經測定，DNA標準Ladder經254nm紫光燈觀察顯色，但樣品無顯色，表明樣品中無雙鏈DNA或RNA檢出存在；樣品經紫外掃描，最大紫外吸收波長為255.2nm，說明樣品中含核苷酸類物質。綜合此兩個結果，樣品中含有低分子量寡核苷酸。

4 多肽檢測

分別用Lowry法[5]進行多肽含量測定和Tris-Tricine 凝膠電泳法[6]進行多肽分子量范圍分析。

4.1 測定方法

4.1.1 Lowry法多肽含量測定

①BSA溶液的制備：精密稱取BSA約10.0mg，置10mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，混勻，精密量取1mL，置10mL量瓶中，加水至刻度，即為100μg/mL的BSA溶液，臨用新制。②樣品溶液：取原液用水稀釋50倍即得。③測定法：取BSA溶液、水和樣品溶液于10mL試管中，混勻，分別按測定試劑盒加入各試劑，混勻，室溫放置30min后，照分光光度法測定650nm處吸光度。④結果計算：用BSA對照品溶液濃度對其相應吸光度作直線回歸（R2≥0.99），由直線方程求出樣品溶液多肽含量。

4.1.2 Tris-Tricine 電泳法多肽分子量測定

按Tris-Tricine電泳法，取原液樣品進行電泳分析。上樣量為20μL，恒壓200V電泳。電泳結束后用考馬斯亮藍染色。

4.2 結果

結果顯示，BSA溶液線形關系很好（圖2），R2＞0.99。根據測定結果帶入直線方程計算，供試品溶液中多肽含量為93.96μg/mL，供試品系樣品稀釋50倍所得，故樣品中多肽含量為4.70mg/mL。同時Tris-Tricine電泳結果顯示，樣品在染色后凝膠上無顯色條帶，表明樣品在Tris-Tricine電泳上無多肽檢出。

圖2 抗結核特異性轉移因子原液多肽測定標準曲線和直線方程

5 抗結核特異性轉移因子原液生物分子物質含量測定總結

本實驗對抗結核特異性轉移因子原液樣品（批號2010060110）進行一系列生物分子物質含量測定，測定結果總結顯示，該樣品中未檢測出脂類物質和雙鏈核酸，明顯檢出糖類物質和多肽，其中糖類物質以核糖為主，因此可以推斷本品主要物質為含單鏈寡核苷酸和低分子量多肽的混合物[7]。

[1]Mtithing J.High-resolution thin-layer chromatography of gangliosides[J].J Chromatography A,1996,720(1/2):3-25

[2]Reese ET,Mandels M.Methods in carbohydrate chemistry[M]//.Whistler RL,ed.New York: Academic Press,1963:139.

[3]Mejbaum WZ.Ober die Bestimmung kleiner Pentosenmengen,insbesonder in Derivaten der Adenylsaiire[J]Physiol Chem,1939,258(1):117.

[4]盧圣棟,現代分子生物學實驗技術[M].2版.北京:中國協和醫科大學出版社,1999.

[5]Lowry OH.Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent[J].J Biol.Chem,1951,193(1):265-275.

[6]Schagger H,Van Jagoe G.Tricine-sodium dodecyl sulfate polyacrylamine gel electrophoresis for separation of protein in the range from 1 to 100 kDa[J].Anal Biochem,1987,166(2):368-373.

[7]中國生物制品規程2000版[S].2000.