豫北地區副豬嗜血桿菌的分離鑒定與耐藥性檢測

王麗榮,董永軍,劉興友,鄧廣付,趙德明

(1.中國農業大學動物醫學院,北京 海淀 100193;2.河南科技學院動物科學學院動物疫病和殘留物防控河南省高校工程技術研究中心,河南 新鄉 453003)

副豬嗜血桿菌(Hps)是副豬嗜血桿菌病的病原菌,引起豬的漿液性、化膿性、多發性漿膜炎,影響2周齡到4月齡的豬,主要在斷奶后和保育階段發病,通常見于5～8周齡的豬,發病率一般在10%～15%,嚴重時死亡率可達50%。隨著我國規模化、集約化豬場的發展,副豬嗜血桿菌病在我國出現流行趨勢,發病率和死亡率均呈上升趨勢,即使能耐過,也會造成仔豬生長發育不良,造成嚴重的經濟損失。

自2009年11月以來,豫北地區幾個市多家豬場仔豬、育肥豬發生精神沉郁,食欲廢絕,體溫高達41℃,呼吸急促;部分病例體溫稍有升高,咳嗽,腹式呼吸,拉稀,逐漸減食,消瘦。剖檢可見豬胸腔內、心包膜內均有多量纖維素性滲出物;肺臟病變尤其明顯,除表面覆有大量纖維素性滲出物外,還有多處結締組織包圍的小化膿灶,全肺出血;全身淋巴結腫大,切面呈大理石花紋樣;腎、十二直腸均有出血點,回盲口附近有扣狀潰瘍,脾臟出血性梗死;患病豬經藥物治療效果不明顯,費用大,豬傷亡較大。而且近一年來該病例在豫北地區發生頻繁,給當地養豬業帶來了較大的損失。

鑒于此,筆者對豫北地區幾個市多家豬場發生仔豬、育肥豬疑似副豬嗜血桿菌病的病例進行了病原的分離鑒定和耐藥性測定,為臨床防治該病提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 病料 豫北地區新鄉市、安陽市、焦作市、濮陽市等多家豬場進行采樣。

1.2 培養基 常規方法配制營養瓊脂后按8%加入新鮮綿羊血,按1%加入過濾除菌的0.01%NAD制成;胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)固體培養基:常規配制TSA固體培養基按5%加入過濾除菌的牛血清,按1%加入過濾除菌的0.01%NAD制成。

1.3 生化試驗試劑 氧化酶、甘露醇、吲哚、葡萄糖、半乳糖、硝酸鹽、蔗糖、脲酶等,均購自杭州天和微生物試劑有限公司,批號:200907;新生胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司,批號:200904;NAD購自上海生工生物工程技術服務有限公司,批號:200906。

1.4 藥敏試紙 復方新諾明、新霉素、慶大霉素、環丙沙星 、鏈霉素、土霉素、四環素、林可霉素等試紙均購自杭州微生物試劑有限公司,批號:200909。

1.5 方法

1.5.1 觸片鏡檢 無菌采取病豬的心血、胸膜腔積水、心包積液、關節積液直接涂片,采取肺、肝、腎、淋巴結觸片,染色鏡檢。

1.5.2 細菌分離培養及培養特性檢查 無菌采取肺臟、胸膜、胸腹腔積水、心包積液、心血、關節液和腦組織等病料,分別接種于巧克力瓊脂平板,對疑似Hps的菌落接種到TSA平板上純化培養。將分離的細菌分別接種于普通瓊脂培養基、血瓊脂平板各2份(各取1份置于5%～10%CO2中培養)。

1.5.3 V因子需要試驗 將分離的細菌分別接種于巧克力瓊脂培養基,培養24～48 h。

1.5.4 衛星現象檢查 將鮮血瓊脂平皿分為兩部分,分別接種所分離的細菌。在其中一部分劃線接種金黃色葡萄球菌,培養24～48 h。

1.5.5 疑似菌株生化鑒定 無菌挑取純化菌落,接種于無NAD的鮮血瓊脂平板上,再垂直劃線接種金黃色葡萄球菌,37℃培養24～48 h,觀察是否有“衛星現象”和溶血現象,取具有“衛星現象”且不溶血的單菌落純培養后接種于脲酶、氧化酶、硝酸鹽還原、吲哚、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麥芽糖等微量生化鑒定管(微量生化鑒定管中同時加入5μL 0.01%NAD及5μL新生胎牛血清),觀察并記錄結果。

1.5.6 藥敏試驗 無菌棉簽蘸取分離菌的肉湯培養物,涂布接種于巧克力瓊脂平板,待稍干燥后,用無菌鑷子將各種藥敏紙片分別平貼于培養基表面,37℃培養20～24 h后,觀察測定抑菌環的大小。

判定標準:抑菌環直徑在15 mm以上的為高度敏感 ;10～15 mm為中度敏感;10 mm以下為低度敏感;無抑菌環的為不敏感。

2 結果

2.1 染色鏡檢 對不同組織、部位所取的病料,經染色后均見到革蘭陰性的細小桿菌。菌體形態多樣,以纖細桿狀者居多,間有長而彎曲絲狀菌體,個別呈兩極濃染的球桿狀。

2.2 分離培養結果 病料接種于巧克力培養基上培養 24～48 h后生長良好,形成針尖大小、圓形、半透明、光滑濕潤的菌落;在普通肉湯和營養瓊脂,37℃培養24 h后,未見細菌生長;在血平板上培養48 h,可見有針尖大小、圓形、邊緣整齊、灰白色半透明的小菌落生長,不表現溶血現象;其中以5%～10%CO2培養的菌落較多,涂片鏡檢,形態和染色特征與直接涂片一致。

2.3 生長因子需要試驗 分離菌在 TSA(含NAD)平板,置37℃,5%CO2培養箱培養48 h,出現無色、透明、濕潤、光滑、邊緣整齊的針頭大小菌落,鏡檢可見大小不一,形態有細長、絲狀、球桿狀的革蘭陰性桿菌,符合副豬嗜血桿菌的形態和染色特征;接種無NAD的TSA不生長。

2.4 衛星現象檢查 接種血瓊脂平板分離菌在金黃色葡萄球菌線兩側有針尖大小、圓形、邊緣整齊的菌落生長,距金黃色葡萄球菌愈近菌落越大,愈遠菌落較小,呈現出明顯的“衛星現象”;而在未接種金黃色葡萄球菌的另半部分則生長不良,菌落稀少,不見“衛星現象”。

2.5 生化試驗結果 見表1。

從表1可得:分離菌發酵葡萄糖、半乳糖、蔗糖;硝酸鹽陽性;氧化酶、吲哚、尿酶陰性,該結果符合副豬嗜血桿菌的生化特性。

2.6 藥敏試驗結果 見表2。

由表2可見,23株分離株對藥物呈現不同的敏感性,有10株對四環素、4株對鏈霉素高度敏感;有10～20株對新霉素、慶大霉素、林可霉素中度敏感;有6～15株對環丙沙星、復方新諾明、土霉素耐藥;而且分離菌株有多株出現多重耐藥性。

表1 分離菌株生化試驗

表2 分離菌株藥敏試驗 (抑菌環直徑:mm)

3 討論與小結

近年來,由副豬嗜血桿菌引起的豬群多發性漿膜炎和關節炎等在我國常有發生,且多發于春冬氣候驟變季節,給規模化豬場造成的經濟損失較大。副豬嗜血桿菌在病料中的分離率比較低,一般患病豬死亡12 h后,在病料中幾乎分離不到,因此需在患豬剖殺或死亡12 h內及時進行病原分離,而且其對營養要求苛刻,其在巧克力培養基上培養48 h生長也較差。一般該菌的分離應采用含NAD、酵母浸出液和10%馬血清的TSA培養基。通過對豫北地區患病豬進行病原菌的分離鑒定、生化試驗,得到了23株副豬嗜血桿菌,對分離菌株進行藥敏試驗,結果顯示該地區流行株嚴重多重耐藥,部分菌株對環丙沙星、四環素高度敏感;6～15株對環丙沙星、復方新若明、土霉素耐藥;而且分離菌株有多株出現多重耐藥性,這也與該病原菌水平傳播和克隆傳播有關。

豬副嗜血桿菌在一個豬場中經常存在幾個菌株或幾個血清型的情況,給疫苗免疫帶來困難;而且耐藥性產生速度較快,藥物治療效果不穩定,故臨床應根據分離菌株藥敏試驗結果進行合理科學的用藥,防止該菌耐藥性的發生及有效治療。

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