7種中藥成分對新城疫病毒感染雞胚成纖維細胞能力的影響

邢玉娟,陳玉庫,胡元亮,王德云,郭振環,蔡丙嚴

(1.江蘇畜牧獸醫職業技術學院,江蘇 泰州 225300;2.南京農業大學中獸醫學研究室,江蘇 南京 210095)

為了研究抗病毒的新型中藥成分復方制劑,首先要篩選主藥。本試驗以新城疫病毒(NDV)為研究對象,在測定氧化苦參堿(oxymatrine,OM)、甘草酸(glycyrrhizic acid,GA)、綠原酸(chlorogenic acid,CA)、梔子苷(geniposide,GP)、虎杖苷(polydatin,PD)、木犀草素(luteolin,LT)、黃芪多糖(astragalus polysaccharide,APS)等7種中藥成分對雞胚成纖維細胞(chickembryo fibroblast,CEF)生長均呈現促進作用的基礎上[1],選取安全濃度范圍內的高、中、低3種濃度,分別與NDV以3種方式加入到培養24 h已長成單層的CEF中,測定它們對NDV感染細胞能力的影響,為研制抗NDV的中藥成分復方提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 中藥成分 GA、CA、LT購自南京青澤醫藥科技開發有限公司,含量分別為98.03%、98.4%、98.03%;GP、PD購自中國生物制品檢定所,含量均為99.0%;OM購自西安富捷生物技術發展公司,含量為98.8%;APS購自南通四海植物精華有限公司,含量為91.9%。根據藥物對CEF安全濃度測定結果,將OM 、GA 、CA 、LT、GP、PD 和 APS分別用細胞維持液稀釋成以下濃度(μg/m L):PD為500、250、125;GA 為 250、125、62.5;APS 和 CA 為125、62.5、31.25;OM 和 GP 為 32、16、8;LT 為1.6、0.8、0.4,常規消毒后備用。

1.2 病毒 新城疫病毒(NDV)F48 E8株,由中國農業科學院上海獸醫研究所惠贈。將病毒按常規方法接種9日齡SPF雞胚(購自中牧股份南京藥械廠),恒溫培養72 h,收獲尿囊液,按Reed-Muench法[2]測定CEF半數組織培養感染劑量(TCID50),用細胞維持液配成100 TCID50濃度備用。

1.3 主要試劑和儀器 MEM細胞培養液,Gibco公司產品,按說明書配制,再加入犢牛血清,達5%為細胞生長液、2%為細胞維持液,再按常規量加入谷胺酞氨和雙抗;胰蛋白酶,進口分裝,用PBS(pH值7.4)配制成0.25%溶液,0.22μm混合纖維素酯微孔濾膜過濾除菌,分裝后-20℃保存備用;M TT(四唑溴鹽)溶液,Sigma公司產品,按說明書配制,使終濃度為 5 mg/m L,0.22μm微孔濾膜過濾除菌,分裝后4℃冰箱保存,1周內用完。

MCO-15AC型CO2培養箱,XDS-1B型生物倒置顯微鏡,DG-5031型酶聯免疫檢測儀,FA-2004N型電子分析天平,MH-1型微量振蕩器,24孔、96孔細胞培養板,細胞培養瓶等。

1.4 試驗方法 根據文獻[2]介紹的方法制備CEF,將細胞數調整至1×106個/mL后加入到96孔細胞培養板中,每孔100μL,37℃、5%CO2條件下培養24 h,細胞長成均勻單層后,翻轉細胞板于滅菌紗布上傾去生長液,用 D-Hank′s液洗兩次,按以下3種方式[3]開始分組加藥。

1.4.1 先加中藥后接種病毒 將高、中、低3種濃度的中藥成分加入到CEF單層中,每個中藥濃度重復4孔,每孔100μL,繼續培養24 h后取出,加中藥的各孔再加入100 TCID50的病毒液,每孔100μL。每個稀釋度分別設中藥對照(中藥100μL,細胞維持液100μL)、病毒對照(接種病毒100μL,細胞維持液100μL)和細胞對照(只加0.2 mL細胞維持液)各4孔。繼續培養,每組以加入病毒液后開始計算時間,每隔12 h觀察1次CPE變化,詳細記錄結果,直至細胞對照組出現典型的CPE病變后為紀錄終點,用M TT法[4]測定570 nm 處 A570值。

1.4.2 先接種病毒后加中藥 將100 TCID50的病毒液加入到CEF中,每孔100μL,每個稀釋度重復4孔;同時設中藥對照、病毒對照和細胞對照。37℃、5%CO2培養箱中培養2 h后取出,然后加入高、中、低3種濃度的中藥成分,每孔100μL。以下方法同1.4.1。

1.4.3 病毒和中藥同時加入 先將100 TCID50的病毒液加入到CEF中,每孔100μL,每個濃度重復6孔,緊接加入高、中、低3種濃度的中藥成分,每孔100μL。同時設中藥對照、病毒對照和細胞對照。以下方法同1.4.1。此外,設僅加維持液的無細胞孔作為測定時調零孔。

1.5 數據處理 計算4孔平均值和標準差,數據以Means±SD表示,用SPSS統計分析軟件進行方差分析和多重比較。比較中藥-病毒組與病毒對照組和中藥-病毒組與同濃度中藥組之間的A570值差異性,判定中藥的抗病毒活性強弱。

2 結果

2.1 OM組的變化 先加中藥、后加病毒,16μg/m L和32μg/mL濃度 A570值顯著高于病毒對照組(P＜0.05),顯著高于和高于細胞對照組;先加病毒、后加中藥,32μg/m L和16μg/m L濃度 A570值顯著高于病毒對照組(P＜0.05);中藥與病毒同時加,16μg/m L和32μg/m L濃度 A570值均顯著高于病毒對照組(P＜0.05)(表1)。

表1 OM在先加、后加和與病毒同時加入時各組細胞A570值

2.2 APS組的變化 先加中藥、后加病毒時,62.5 μg/m L和125μg/mL濃度組的A570值顯著高于病毒對照組(P＜0.05)。62.5μg/m L濃度組的 A570值高于細胞對照組;先加病毒、后加中藥時,31.25 μg/m L和62.5μg/mL濃度組A570值顯著高于病毒對照組(P＜0.05);與病毒同時加,125、62.5、31.25 μg/m L濃度 A570值顯著高于病毒對照組(P＜0.05)。31.25μg/m L A570值高于細胞對照組(表2)。

2.3 GP組的變化 先加中藥、后加病毒,32μg/m L濃度 A570值顯著高于病毒對照組(P＜0.05);先加病毒、后加中藥,32μg/m L濃度 A570值高于病毒對照組,但不顯著,中、低濃度的 A570值低于病毒對照組;中藥與病毒同時加,32μg/m L和8μg/m L濃度組的 A570值稍高于病毒對照組(表3)。

表2 APS在先加、后加和與病毒同時加入時各組細胞 A570值

表3 GP在先加、后加和與病毒同時加入時各組細胞A570值

2.4 GA組的變化 先加中藥、后加病毒,250μg/mL和125μg/mL濃度A570值顯著高于病毒對照組(P＜0.05);先加病毒、后加中藥,只有 125μg/m L濃度A570值高于病毒對照組,但不顯著;與病毒同時加,250μg/mL濃度 A570值顯著高于病毒對照組(P＜0.05)(表4)。

表4 GA在先加、后加和與病毒同時加入時各組細胞A570值

2.5 CA、PD和LT組的變化 CA、PD和 LT 3種中藥成分無論是哪種加藥方式均無抑制病毒感染細胞能力的作用。

3 討論

3.1 中藥成分對NDV感染CEF能力的影響 本試驗結果表明,在先加中藥、后加病毒時,OM在高、中濃度,GA在高、中濃度,A PS在高、中濃度,GP在高濃度時具有顯著的抑制病毒感染細胞能力的作用;先加病毒、后加中藥時,OM 高、中濃度,APS中、低濃度有顯著的抑制病毒生長作用;中藥與病毒同時加入時,OM 高、中濃度,A PS高、中、低濃度,GA高濃度有顯著抑制病毒感染細胞能力的作用。綜合以上結果,4種中藥成分抑制病毒感染細胞能力的作用依次為:OM＞APS＞GA＞GP。而CA、PD和LT 3種中藥成分無論是哪種加藥方式均無抑制NDV增殖作用。

3.2 中藥成分抑制病毒感染細胞能力的量效關系 試驗中發現,中藥先于病毒加入時,OM、APS、GA在高、中濃度,G P在高濃度對病毒生長有抑制作用;在后于病毒加入時,OM 在高、中濃度、APS在中、低濃度有抑制病毒生長作用;在與病毒同時加入時,OM在高、中濃度,GA在高濃度,APS在高、中、低濃度對病毒生長有抑制作用。說明中藥成分必須有合適的劑量才能發揮最佳效應,很多研究都證明了這一結論[5-7]。

3.3 關于中藥成分抑制NDV感染細胞能力的作用機制 本試驗中,4個中藥成分在先于病毒加入時抑制作用最強,在與病毒同時加時也起到了很顯著的抑制作用,表明中藥成分或通過改變細胞膜表面的病毒吸附蛋白受體,或作用于細胞內而提高其抵抗力,阻止病毒侵入細胞而發揮預防作用,或通過直接滅活病毒來保護細胞[8-9];先接種病毒后加中藥,OM和APS高、中、低濃度,GP高濃度,GA中濃度均有一定的抑制作用,表明中藥成分特別是OM和APS在病毒感染細胞后也可發揮抗感染能力,從而起到治療作用。

[1]陳玉庫,邢玉娟,蔡丙彥,等.氧化苦參堿等七種中藥成分對雞胚或纖維細胞增殖的影響[J].黑龍江畜牧獸醫,2009,8:103-105.

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