HPLC法測定迷迭香中鼠尾草酸含量的試驗

李宇偉,連瑞麗,劉永錄,解克偉

(1.鄭州牧業工程高等專科學校藥物工程系,河南 鄭州 450011;2.禹州市森源本草天然產物有限公司,河南 禹州 461670)

迷迭香又名油安草,具有清除自由基、消炎、抗病毒等多方面的功效,主要成分鼠尾草酸的抗病毒作用較強[1-2]。目前,提取迷迭香中的鼠尾草酸采用的方法主要有溶劑浸提法、勻漿法、回流法、超臨界提取法、超聲法等。我們經多次試驗,超聲法相比其他方法更適合工廠化生產。國內外對迷迭香中的鼠尾草酸的測定,主要采取液相色譜-質譜聯用和高效液相色譜法。高效液相色譜主要采用梯度洗脫法,分析時間長。我們采用高效液相色譜配合紫外檢測器,以乙腈-水為流動相,等度洗脫,鼠尾草酸在25 min左右出峰,且峰形良好,靈敏度高,重現性好,樣品譜圖中雜質干擾較少,樣品中鼠尾草酸的峰形及與其他雜峰的分離度最為理想。本試驗以禹州市森源本草天然產物有限公司中藥GAP生產基地的不同采收期迷迭香葉片為材料,采用有機溶劑提取和分離其中的鼠尾草酸,建立了高效液相色譜法測定其含量,用此方法作為測定迷迭香中的鼠尾草酸的含量,非常適合于迷迭香的質量控制,并為該產品的深度開發與利用提供依據。

1 儀器與試藥

Mlli-Q超純水系統(美國Mllipore科技有限公司);FA-1104型電子分析天平(上海精勝科學儀器有限公司);LD-06A型六兩裝高速中藥粉碎機(上海科達醫學儀器設備有限公司);高效液相色譜儀(1525控制泵,2487紫外檢測器,美國Waters公司);KQ-250DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)。所用的玻璃器皿等用具均經10%硝酸浸泡48 h后,用超純水洗凈。試驗用迷迭香葉片采自河南禹州市森源本草天然產物有限公司藥用植物GAP生產基地,采收后自然陰干,經測定含水率為9.5%,經過鄭州牧專生藥學實驗室趙建平教授鑒定性狀,為迷迭香屬植物迷迭香的葉片無誤。藥品:鼠尾草酸標準品購于中國藥品生物制品檢定所,為含量測定用;乙腈為色譜純,購于美國Sigma-Aldrich公司;2次蒸餾水,自制;其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:DiamonsilRC18(200 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈-水(60∶40);紫外檢測器測定鼠尾草酸檢測波長為230 nm;采用等度洗脫,流速為0.8 mL/min;進樣量10μL;柱溫:30℃;調節pH值為4.5～5.0;靈敏度:0.5AUFS[3]。在上述條件下,鼠尾草酸在25 min左右出峰,且峰形良好,其中230 nm是最大吸收波長(見圖1),靈敏度高,重現性好,同時在230 nm處,樣品譜圖中雜質干擾較少,選用乙腈做流動相,柱效高,基線平穩,峰形、分離效果最好,樣品中鼠尾草酸的峰形及與其他雜峰的分離度最為理想。

圖1 鼠尾草酸紫外吸收光譜圖

2.2 標準溶液的制備 用電子天平精密稱取105℃干燥4 h后至質量恒定的的鼠尾草酸標準品10.0 mg、5.0 mg,置于 50 mL 棕色容量瓶中,用70%乙醇溶解并稀釋至刻度定容,搖勻,其濃度分別為200 mg/L、100 mg/L,作為標準溶液。置于冰箱中避光保存,臨用時用流動相稀釋至不同的濃度。

2.3 供試品溶液的制備 選取迷迭香植物的葉片篩選去除沙石等機械雜質后進行切斷處理(約1 cm),采用水上蒸餾法蒸出揮發油,自然陰干后粉碎,并過孔徑 0.85 mm的藥篩。精密稱取樣品1.000 g(精確至0.001 g)置于錐形瓶中,按料液比1∶50(m/V)加入95%乙醇50 m L,超聲提取 60 min,用乙醇定容至50 m L,用0.45μm的微孔濾膜濾過,取濾液作為供試品溶液。根據含量高低稀釋成上機液,按上述色譜條件進樣分析[4]。每項試驗平行3次。

2.4 測定方法的驗證

2.4.1 線性關系的考察 分別精密量取制備好的標準溶液 1.0、2.0 、3.0、4.0、5.0、10.0 m L 置于 10 m L棕色容量瓶中,用流動相稀釋定容成10 mL,配制成系列質量濃度的標準溶液,各進樣10μL進行分析測定,記錄色譜圖,以峰面積A為縱坐標,質量濃度C(g/L)為橫坐標,根據色譜結果,繪制標準曲線(圖2)[4-5]。并對峰面積進行回歸,計算線性回歸方程。鼠尾草酸在0.0087～0.0558 g/L呈良好的線性關系,其線性回歸方程及相關系數為:y=2685.6 x-4.9472,R2=0.9998(n=6)。在上述色譜條件下,以信噪比S/N=3計算檢出限,表明峰面積與樣品質量濃度呈良好的線性關系,線性范圍寬,檢出限低。測得鼠尾草酸的最小檢出限為0.058 mg/L。

圖2 鼠尾草酸的標準曲線

2.4.2 精密度試驗 在上述色譜條件下,分別精密吸取質量濃度為25、50、100 mg/L的標準溶液加入空白樣中,每個濃度水平重復進樣6次,測定其峰面積,計算 RSD。RSD值在 0.61%～1.02%,表明分析結果的精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 分別精密吸取同一供試品溶液 10 μL,每6 h左右進樣 1次,分別在 0、6、12、24、48 h進行測定、記錄鼠尾草酸的峰面積,以峰面積計算RSD。RSD值為2.18%(n=5),說明供試品溶液在室溫條件下放置30 h比較穩定。

2.4.4 重復性試驗 精密稱取同一批號樣品粉末0.500 g(精確至 0.001 g),共6份 ,進樣10μL,按外標法計算。測得迷迭香鼠尾草酸平均質量分數為2.59%,RSD值為1.08%(n=6),說明該方法的重復性良好。

2.4.5 回收率試驗 精密稱取已知鼠尾草酸質量分數(2.59%)的迷迭香粉末0.100 g(精確至0.001 g)作為空白樣品,分別置于50 m L量瓶中,每3份為1組,分別準確加入鼠尾草酸標準貯備液10.0、20.0、30.0 m L,取10μL 注入液相色譜儀,測定計算3種濃度(低、中、高)的加樣回收率,平行測定6次[6]。結果見表1,表明本方法鼠尾草酸回收率在98.0%～100.8%,平均回收率為99.5%(n=6)。說明利用此方法測定迷迭香中的鼠尾草酸是可行的,其所得數據是可靠的,該方法定量準確,重復性好,符合測試要求。

表1 加樣回收率試驗結果

2.5 樣品測定 精密稱取不同批次(按日期編號)的迷迭香葉片樣品20.000 g(精確至0.001 g),精密吸取各樣品溶液各10μL,分別進樣,注入液相色譜儀進行測定,每項試驗平行3次,按外標法定量,以峰面積取平均值,代入回歸方程,計算樣品中鼠尾草酸的質量分數,結果見表2。

表2 不同采收期迷迭香中鼠尾草酸的質量分數(%,n=3)

3 小結與討論

本文對不同采收期的迷迭香樣品采用HPLC法對其中的鼠尾草酸的含量進行測定,運用DiamonsilRC18(200 mm×4.6 mm,5μm)作為分析柱進行測定,選用乙腈做流動相,乙腈和水比例為60∶40,采用等度洗脫,流速為 0.8 m L/min,檢測波長為230 nm,進樣量 10μL,柱溫:30℃;p H 值4.5～5.0。通過對線性關系的考察、精密度試驗、穩定性試驗、重復性試驗和加樣回收率試驗對測定方法進行了驗證,結果表明,鼠尾草酸在 0.0087～0.0558 g/L呈良好的線性關系,其線性回歸方程及相關系數為:y=2685.6 C-4.9472,R2=0.9998(n=6),平均回收率為99.5%。通過驗證表明,該方法靈敏、定量準確,重現性好,且分析時間短,符合測試要求,可用于迷迭香中鼠尾草酸的含量測定。

[1]張春艷.迷迭香酸的提取與分離純化工藝研究[J].中國釀造,2009,75(7):75-77.

[2]楊磊,肖長文,趙春建,等.pH控制勻漿法從迷迭香中提取鼠尾草酸[J].黑龍江大學自然科學學報,2008,25(4):514-518.

[3]何默忠,葛秀丹,陳正收,等.反相高效液相色譜法測定迷迭香中鼠尾草酚、鼠尾草酸和熊果酸含量[J].上海醫藥,2009,30(10):469-470.

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[6]吳良,袁干軍,蘇秋玲.高效液相色譜法測定迷迭香中迷迭香酸的含量[J].海南醫學院學報,2006,12(2):112-114.