羽衣甘藍親緣關系分析

常青

(遼寧省葫蘆島市園林管理處,遼寧 葫蘆島 125000)

1 引言

羽衣甘藍(Brassica oleracea var.acephala f.tricolor Hort.)是十字花科蕓薹屬甘藍種的一個變種,兩年生草本花卉,又名葉牡丹。其葉形美觀多變,心葉色彩豐富艷麗,耐寒性極強,是難得的秋冬季及早春室內外綠化的好材料,現在各地廣為栽培[1]。

RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)技術是Williams[2]于1990年首先創立的一種DNA分子標記技術。它利用隨機的10個堿基的寡核苷酸作為引物,對基因組DNA進行PCR擴增。這些擴增DNA產物片段的多態性反映了基因組相應區域的DNA多態性[3]。

本實驗應用RAPD技術從64個隨機引物中篩選出適宜的RAPD引物,對14種羽衣甘藍新品種基因組DNA進行多態性研究,以分析羽衣甘藍的親緣關系,為今后配置更加合理的雜交組合提供分子依據。

2 材料與方法

2.1 供試材料

本試驗采用從國內外收集的羽衣甘藍新品種14份,作為供試材料。

2.2 實驗方法

2.2.1 羽衣甘藍總DNA的提取及檢測

實驗采用改進CTAB法提取羽衣甘藍基因組DNA,將0.1g嫩葉在液氮中迅速研碎,取0.05g粉末迅速移入1.5mL離心管中,立即加入65℃預熱的CTAB提取緩沖液500μ L,65℃水浴30min,期間顛倒幾次;加入等體積氯仿/異戊醇(24∶1)抽提2次。取上清液,加無水乙醇,-20℃放置 1h。10000r/min離心;棄上清,加入 TE溶解,顛倒混勻,然后再10000r/min離心;將上清液轉入新1.5mL 離心管中 ,加入 RNase(10μ g/μ L),輕輕混勻后在37℃水浴1h;取出靜置,冷卻至室溫后,加入1/10體積NaAc(pH5.2)和2倍體積無水乙醇,顛倒混勻后-20℃放置 1h。10000r/min離心;棄上清,用70%乙醇洗滌沉淀2次,放置超凈工作臺上吹干;加入 50μ LT E溶解;置于 4℃備用或 -20℃儲藏。

提取的羽衣甘藍基因組DNA通過凝膠電泳檢測,加樣于0.8%(m/v)瓊脂糖凝膠(含核酸染料,0.5μ g/mL),在 LKB型電泳儀中電泳,并以 DNA分子量標準作對照,估測 DNA分子量。紫外燈365nm波長下觀察、照相。

2.2.2 RAPD擴增

反應程序為94℃預變性5min;94℃變性30s,37℃退火30s,72℃延伸1min,40個循環;最后72℃延伸7min。原始20μ L反應體系:2μ LlO×PCR反應緩沖液;1.5mmol/LMgCl2;0.2mmol/LdNTP;0.3μ mol/L 引物;稀釋 10 倍的總 DNA5μ L;1UTaq酶;滅菌的超純水補齊體積到20μ L。以上藥品均購自TIANGEN生物制劑(北京)有限公司,引物由寶生物工程(大連)有限公司合成,擴增反應在Whatman Biometra GmbH(Germany)公司生產的 TGradient Thermobolck擴增儀中進行。

社交媒體營銷所針對的目標市場。在使用社交媒體所針對目標市場的問題上，11家酒店既表現出了相似性，又表現出了差異性。6家酒店表示他們的社交媒體平臺既關注已經購買過酒店產品的消費者，也關注潛在的未來消費者。另外5家酒店主要關注新客戶和潛在的未來客戶。雖然有3家酒店表示他們不會通過社交媒體平臺去關注特定的消費群體，但其余的8家酒店或多或少地會只關注他們認為符合自己酒店品牌特色的消費群體。

2.2.3 擴增產物分析

擴增產物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳,在紫外燈(TCP-15-M型)下觀察并照相。將RAPD圖譜上清晰穩定出現的條帶記為“1”,同一位置沒有條帶記為“0”,將條帶信息轉換成由“0”和“1”組成的原始矩陣。應用DPS(version3.01)軟件計算各材料間歐氏遺傳距離,采用類平均距離法(UPGMA)構建聚類圖,分析各品種之間的親緣關系。

3 實驗結果分析

3.1 提取基因組DNA質量檢測

通過瓊脂糖凝膠電泳,可以得出所提取的樣品DNA在20kb左右,沒有出現斷裂和降解,因此,可用于PAPD的PCR擴增。進一步用紫外分光光度法測得OD260/OD280值均在1.8～2.0之間,表明用改良CTAB法所提取的DNA質量較高,可以滿足下游的PAPD反應對模版純度的要求。

3.2 RAPD體系優化

在原始RAPD反應體系基礎之上,采用單因素法調整反應體系各組分的濃度,摸索建立更加適合羽衣甘藍的RAPD反應體系。

3.2.1 模板濃度的影響

為確定適宜的RAPD分析的DNA濃度,試驗設置6種DNA濃度梯度,依次為稀釋1倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍。結果表明:模板濃度在稀釋1倍和10倍時,擴增條帶清晰,在稀釋20倍以后開始模糊,稀釋100倍和200倍時非特異擴增明顯增加。所以本試驗選取稀釋 10倍的模板作為RAPD反應的濃度。

3.2.2 MgCl2濃度對RAPD擴增效果的影響

3.2.3 dNTP濃度對擴增的影響

dNTP濃度也是影響RAPD擴增的重要因素,試驗dNTP濃度設置為 0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L。由圖 4可以看出 dNTP濃度為0.05mmol/L、0.1mmol/L時無明顯擴增條帶,濃度為0.4mmol/L時條帶清晰,擴增帶數、帶型和帶的明暗程度都處于較理想狀態,試驗選取0.4mmol/L作為正式擴增條件。

3.2.4 TaqDNA聚合酶用量對RAPD的影響

試驗設置了6個 TaqDNA梯度,0.5U、1.0U、1.5U、2.0U、2.5U、3.0U。試驗結果表明:Taq酶具有很高的活性,在低濃度下也有擴增效果,但擴增量少。在1.5U時,條帶清晰且亮度明顯增強。隨著用量增加條帶亮度稍有增加,但逐漸有非特異擴增出現。所以確定Taq聚合酶濃度為1.5U。

3.2.5 引物濃度對RAPD擴增的影響

試驗同時對引物濃度進行了優化,引物梯度設置 為:0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L。依據試驗結果確定較適合的引物濃度為0.4mmol/L。最終確立適合羽衣甘藍基因組的RAPD擴增反應體系為:2μ LlO×PCR反應緩沖液;2.0mmol/LMgCl2;0.4mmol/LdNT P;0.4μ mol/L 引物;稀釋 10 倍的總DNA5μ L;1.5UTaq酶;滅菌的超純水補齊體積到 20μ L。

3.3 引物的篩選

用優化后的反應體系,選取一個品系DNA對64個引物進行篩選。每個引物都有擴增產物,從中篩選出10條擴增譜帶清晰、穩定且多態性好的引物用于聚類分析。

利用獲得的RAPD標記,用UPGMA法建立了14份羽衣甘藍新品種之間的遺傳關系聚類分析圖。在歐氏遺傳距離為4.7處,14個品種分成4類。第1類4個品種,均為圓葉;第 2類 4個品種,為羽葉和圓葉;第3類5個品種,均為皺葉品種;第 4類為品種14,田間性狀為皺葉白心。其中遺傳距離最近的為3和4,歐氏距離值為2.449,這2個品系農藝性狀都表現為皺葉粉心;聚類圖中品系 2、3、4、5首先聚在一起,其農藝性狀較近似,田間試驗結果驗證了這些材料的同源性很高,與聚類結果相一致;而品種14雖表現為皺葉,但其葉色和株型與其它皺葉品種有較大差異,所以與其它皺葉品種親緣關系較遠。

4 結語

從試驗結果看,改良CTAB法提取得到的DNA其純度和濃度均達到了RAPD反應對模板的要求。提取過程中有效去除較多的蛋白質和多糖類物質是保證高質量DNA的關鍵,針對羽衣甘藍中糖及蛋白含量高的特點,本方法中用氯仿/異戊醇抽提兩次,可有效地解決這一問題。

RAPD是利用寡聚核苷酸對基因組DNA進行多態性分析,檢測區域幾乎覆蓋了整個基因組,因而可以檢測不同品種間微小差異。從試驗結果看,供試材料間存在較明顯的差異,即使一些性狀表現相近的品種間也存在多態性。因此,RAPD技術用于羽衣甘藍品種間親緣關系分析是可行的。

在RAPD聚類分析中,將羽葉品系和圓葉品系分別聚為一類,表現了田間試驗與本試驗的一致性。同時也看到聚類圖中將羽葉品系13和圓葉9品系首先聚到一起后又和羽葉品系6在歐氏距離3.95處聚到一起,說明羽葉品系13和圓葉品系有較近親緣關系。也可能說明 RAPD可以檢測出葉型差異所造成的遺傳差異,另一方面也說明可能篩選引物的數量還不足以完全檢測出各品系間的差異。

[1]饒璐璐.羽衣甘藍(kale)[J].蔬菜,1997(1):11～12.

[2]王關林,方宏筠.植物基因工程原理與技術[M].北京:科學出版社,1998.

[3]孫彩霞,張明永.中國蘭屬植物種間及品種間親緣關系的RAPD分析[J].園藝學報,2005,32(6):1121～1124.