心律寧片劑中氧化苦參堿的萃取及其含量測定的研究

高洪燕 張 詠

黑龍江省醫院藥劑部，黑龍江哈爾濱 150036

苦參為豆科植物苦參的干燥的根，具有清熱燥濕、殺蟲止癢，利尿等功能。其有效成分生物堿含量較高，主要為：苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿等20余種。大多數單堿對多種類生物（如真菌、細菌、線蟲、昆蟲、哺乳動物包括人類）有多方面的生物活性。尤其近年來發現的抗癌而又增強免疫力等獨特的藥理作用為醫藥界所矚目。

在超臨界CO2流體萃取（CO2-SFE）中，由于處于超臨界狀態下的CO2流體兼顧液體及氣體的傳質特點，且超臨界CO2流體萃取的特性和極性還可以通過調節萃取壓力、溫度、加入不同品種的夾帶劑等因素方便的調節，從而使超臨界CO2流體萃取顯示了快速、提取效率高、選擇性好等特點[1]，中藥中的生物堿等極性偏大，加大壓力后，CO2流體的密度和解電常數增大，極性增強：加入夾帶劑也可有效地增大流體的溶解性能，促進成分的溶出[2]。本實驗用76%的乙醇作為夾帶劑對苦參中的氧化苦參堿進行提取。并用高效液相色譜法，以YWG-NH2為固定相，乙腈-無水乙醇-磷酸水溶液為流動相，測定氧化苦參堿的含量，現將實驗結果介紹如下。

1 儀器和試劑

FY221-50-60型超臨界萃取裝置（哈爾濱市天宇科技開發有限公司）；美國WATERS高效液相色譜儀；600高壓雙泵；2996二極管陣列檢測器；7725i定量進樣閥；Millenium 32系統軟件。

氧化苦參堿對照品由中國藥品生物制品檢定所提供；中藥材由黑龍江省綏化市藥品檢驗所提供；檢定乙腈為HPLC級；水為純化水；二氧化碳（99.99%）由市化工廠提供；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：YWG-NH2，250 mm×4.6 mm，10μm，流動相：乙腈∶無水乙醇∶水（80∶10∶10，磷酸調pH=2）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：220 nm；用外標法檢測。

2.2 超臨界CO2流體萃取的條件

2.2.1 堿化試劑的選擇 生物堿在植物中多數以鹽的形式存在，若直接用極性較弱的溶劑提取，往往提取不完全，所以在提取前需先堿化，使之全部轉化為游離堿，堿化劑可采用Ca（OH）2、三乙胺或氨水，由于Ca（OH）2不易溶于水，且易產生雜質，而三乙胺對萃取槽的腐蝕性也較大，故本實驗采用氨水作為堿化劑，以投料量的二倍量浸泡過夜。

2.2.2 萃取壓力的選擇[3]物質處于其臨界溫度（Tc）、臨界壓力（Pc）以上時，成為單一相態，稱為超臨界流體。所以考察壓力對提取率的影響，必須選擇臨界壓力以上的壓力。在超臨界流體中，壓力越大，則流體的密度越大，萃取的能力越強，但對于雜質的萃取量也隨之增加。CO2的臨界壓力為7.534 MPa。而在提取生物堿時，35 MPa和42 MPa樣品的提取率間有非常顯著的差異，但隨提取壓力的增加，雜質的提取率也有增加，所以選擇42 MPa為本實驗的萃取壓力。

2.3 氧化苦參堿的提取

苦參干粉末投料300 g，加0.1 mL/L氨水600 mL浸泡過夜，次日投入萃取釜中，于45℃、CO2流量0.70 nm3/h連續萃取。萃取過程中分3次加入夾帶劑約200 mL，1.5 h后第1次收集萃取液，以后每隔0.5 h收集一次，直到無萃取液產生。整個萃取過程約為2 h，收集萃取液約100 mL，其上層為淺黃至棕黃色透明液體，底部有少許棕黃色沉淀。

2.4 萃取液中苦參堿及氧化苦參堿的總含量測定

2.4.1 線性范圍 貯備液制備：精密稱取氧化苦參堿對照品2 mg，置25 mL量瓶中，用無水乙醇溶解，稀釋至刻度，搖勻備用。線性范圍：精密量取上述貯備液 0.25、0.50、1.50、2.50、3.50、4.50 mL置10 mL量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，按上述色譜條件進樣10μL，記錄峰面積，以對照液濃度（C）與其相應峰面積（A）A=277762.0C-10870.0，r=0.9994，線性范圍為 0.4 ～ 0.5μg/mL。

2.4.2 精密度實驗 取線性方程中1、2、4號對照品，分別進樣5μL，測定其峰面積，計算 RSD（n=5）分別為 0.9%、1.1%、1.7%。

2.4.3 加樣回收率 精密量取6份萃取液1 mL，分別加入儲備液0.5、1.0、1.5 mL置于10 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，以濾膜過濾，分別進樣5μL，測量峰面積，計算加樣回收率平均為98.72%，RSD=3.2%（n=6）。

2.4.4 樣品測定 精密量取萃取液1 mL，轉移至10 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，以濾膜過濾，即得供試液，平行制樣5份。取上述溶液各5μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，以外標法計算氧化苦參堿含量。樣品色譜圖及對照品色譜圖，結果表明5份樣品的氧化苦參堿含量平均值為4.82%，RSD=2.13%。

2.4.5 穩定性實驗 取線性方程中1、3、5號對照品，分別間隔1 h進樣5μL，測定面積，計算變異系數RSD（n=5）為1.7%。隔日再取上述樣品進樣，計算日間變異系數RSD（n=5）為1.2%。上述結果表明，氧化苦參堿其日內日間均表現良好穩定性。

3 討論

在夾帶劑的選擇中，常用的有乙醇、甲醇、苯等有機溶劑，考慮到生物堿易溶于有機溶劑，以及乙醇對儀器的腐蝕性最小，因此實驗前擬定乙醇為夾帶劑。并根據參考文獻[4]選取4種濃度的乙醇溶液（95%、80%、76%、70%）作為夾帶劑分別進行實驗性驗證，結果表明，以76%濃度的乙醇作為夾帶劑的提取率均高于其他3種濃度的乙醇作夾帶劑時的提取率，與文獻一致。

苦參中的生物堿主要有苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿等20余種[5]，其中苦參總堿占到全部生物堿的3%～5%。且在苦參的冷浸出液中，以氧化苦參堿為主，而加熱或煎煮可能使氧化型堿轉化為相應的非氧化型堿。由于在超臨界CO2流體萃取中，提取溫度不高，溫度變化范圍小，且提取條件穩定，因此對于提取率標識物的確定，選擇了氧化苦參堿。

在本實驗中，對于苦參中氧化苦參堿的提取時間為2 h，消耗有機溶劑為200 mL，氧化苦參堿提取率為4%～5%，其各項數值均優于傳統的回流萃取法，充分顯示了超臨界CO2流體萃取的科學性。僅對超臨界CO2流體萃取的重要因素如夾帶劑、萃取溫度、萃取時間、萃取壓力進行了考察。而影響超臨界CO2流體萃取的因素還有很多[6]，如分離壓力、CO2的流量及夾帶劑的流量等。且超臨界CO2流體萃取的條件決定了它特別適合于提取脂溶性成分，而利用超臨界CO2流體萃取生物堿的應用并不廣泛，各種條件尚在探討之中，因此，利用超臨界CO2流體萃取法提取各種生物堿有待于更進一步的研究。

[1] 龐樹和，田葳，潘淑明.HPLC法測定心律寧片（苦參總堿片）中苦參堿和氧化苦參堿的含量[J].中醫藥信息，2002，19（1）：15-17.

[2] 向柏，孫英華，張媛，等.RP-HPLC法測定苦參總堿中苦參堿、氧化槐果堿和氧化苦參堿 [J]. 中草藥，2005，36（12）：16-19.

[3] 艾雄，曾三平.高效液相色譜法測定當歸苦參丸中苦參堿和氧化苦參堿[J].中南藥學，2007，5（2）：9-11.

[4] 章育中，張淑蓉，崔建芳，等.苦參及其制劑中生物堿的薄層分離和含量測定 [J].藥學學報，1981，10（4）：9-12.

[5] 張寶恒，申軍.抗心律失常中藥的研究進展[J].中成藥，1981，9（5）：26-28.

[6] 龐樹和，田葳，潘淑明.HPLC法測定心律寧片（苦參總堿片）中苦參堿和氧化苦參堿的含量[J].中醫藥信息，2002，5（1）：52-53.