組織蛋白D和E-鈣黏附蛋白與乳腺癌患者預后的關系

馬思泉

山東省菏澤市第二人民醫院胸外科，山東菏澤 274005

乳腺癌近年來發病率呈直線上升趨勢，而且發病年齡趨于年輕化，而遠處轉移是患者的主要死亡原因。目前患者體內存在的微小轉移癌灶尚難發現，早期篩選出具有轉移危險性的患者，予以徹底控制是提高乳腺癌療效的關鍵。本研究旨在探討組織蛋白酶D（cathepsin D，Ca-D）和E-鈣黏附蛋白（epithelial Cadherin， E-Ca）在乳腺癌組織中的表達情況，并預測其在預后估計中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集筆者所在醫院2002～2008年手術切除后經病理證實，且有3年以上隨訪資料的女性乳腺癌患者106例作為研究對象，同時選取乳腺增生性病變即纖維腺瘤作為對照。患者年齡21～81歲，采取乳腺癌根治或改良根治術。患者術前未經過任何治療，術后進行正規化療。

1.2 分組

按照同側腋窩淋巴結有無轉移及轉移個數分為3組：無淋巴結轉移者為第1組，轉移個數1～3個（含3個）者為第2組，轉移個數4個或4個以上者為第3組。

1.3 染色方法及結果判斷標準

采用鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶法（S-P法）染色法（S-P試劑盒及一抗均購自福州邁新公司），DAB顯色，實驗步驟嚴格按照說明書進行。用已知陽性切片作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.4 結果判斷

采用雙盲法。陽性結果呈棕黃色顆粒狀，隨機選取10個高倍視野，計算著色腫瘤細胞占細胞總數的百分比。按照參考文獻對不同抗體染色結果進行判斷，CD34染色標記血管內皮細胞，先在低倍鏡下找到新生血管密集區，在200倍視野下觀察、計數5個視野下血管總數，取其平均值作為該患者的微血管密度（microvessel density，MVD）。

1.5 統計學分析

采用SPSS1.0統計軟件處理。

2 結果

2.1 一般資料

以觀察滿3年時患者生存狀態為判斷依據，其中無瘤存活者55例（文中以后稱無復發組），出現局部復發或遠處轉移者51例（文中以后稱復發組）。腫瘤發生部位左側（61例）多于右側（45例）。混合性癌12例，浸潤性導管癌77例，浸潤性小葉癌17例（分析數據時將混合型和小葉癌合并），浸潤性導管癌明顯多于小葉癌，兩者比例約4.5∶1。

2.2 E-Ca在乳腺癌組織中的表達及臨床意義

2.2.1 E-Ca蛋白在乳腺組織中的表達 E-Ca在正常乳腺癌組織內呈強表達，在癌組織內表達減弱。E-Ca的陽性率在浸潤性小葉癌中為51.7%（15/29），導管癌中為76.4%（55/72），兩組差異有統計學意義。

2.2.2 E-Ca蛋白表達相關因素 E-Ca蛋白表達與淋巴結轉移呈相關趨勢，低表達者容易發生淋巴結轉移。淋巴結轉移灶E-Ca蛋白表達降低。E-Ca蛋白表達與復發、部位、腫瘤大小、生存期均無關。

2.3 Ca-D在乳腺癌組織中的表達及臨床意義

2.3.1 Ca-D在乳腺癌組織內的表達 Ca-D在正常乳腺癌組織內無表達或微弱表達，在腫瘤組織內表達明顯增強。Ca-D在乳腺腫瘤實質細胞和間質細胞內都有不同程度的表達，不同腫瘤表達部位有所不同。

2.3.2 Ca-D在乳腺癌組織不同部位表達相關因素 分別觀察Ca-D在乳腺腫瘤實質細胞和間質細胞內的表達，結果發現：①間質內Ca-D的表達與淋巴結轉移、復發呈正相關：低表達組淋巴結轉移率為50%（12/24），復發率為33.3%（8/24），中表達組轉移率為60.7%（17/28），復發率為42.9%（12/28），強表達組轉移率為79.1%（34/43），復發率為69.8%（30/43）； 強表達組轉移、復發率高，與生存期呈負相關。②腫瘤實質內Ca-D的表達與淋巴結轉移、生存狀態及生存期無關。

Ca-D表達與腫瘤大小、病理類型、年齡無關。

2.4 乳腺癌組織中MVD的臨床意義

2.4.1 MVD與生存狀態的關系 存活組MVD最小值43，最大值158，平均值79.8947，標準差為25.4418；復發組MVD最小值36，最大值2.6，平均值103.1136，標準差為33.3635，兩組差異有統計學意義（F=12.246，P=0.001）。

2.4.2 MVD與生存期的關系 MVD與生存期存在負相關（r=-0.301，P=0.006），MVD 越高，生存期越短。

MVD與淋巴結轉移、腫瘤直徑、病理類型均無相關性。

2.5 nm23-H1在乳腺組織中的表達及其生物學意義

2.5.1 nm23-H1蛋白在乳腺組織內的表達 nm23-H1蛋白在良性乳腺病變內呈強表達，在乳腺癌組織中表達下降，在無淋巴結轉移的癌組織可見強表達，尤其是在轉移或復發病灶甚至無表達。

2.5.2 nm23-H1蛋白表達與淋巴結轉移的關系 nm23-H1低表達組淋巴結轉移率為83.3%（25/30），高表達組淋巴結轉移率為54.5%（24/44），nm23-H1蛋白表達水平與淋巴結轉移呈負相關。

2.5.3 nm23-H1蛋白表達與生存狀態的關系 nm23-H1低表達組復發率為76.7%（23/30），高表達組復發率為40.9%（18/44）， 低表達組復發率高于高表達組。nm23-H1蛋白表達水平與復發呈負相關。

2.5.4 nm23-H1蛋白表達與生存期的關系 nm23-H1高表達

者存活時間長，低表達者存活時間短，nm23-H1蛋白表達與生存期呈正相關。

2.5.5 nm23-H1和腫瘤實質內Ca-D的關系 本實驗發現nm23-H1和腫瘤實質內Ca-D的表達存在相關性，兩者同時低表達者占12.5%（9/72），同時高表達者占47.2%（34/72），兩者呈正相關（r=0.264，P=0.025），目前尚未見該方面報道。

3 討論

3.1 E-鈣黏附蛋白和微血管密度與乳腺癌患者預后的關系

E-鈣黏附蛋白是一類介導細胞間粘連作用的跨膜糖蛋白，對維護上皮細胞的形態和結構完整性起著重要作用。E-Ca表達下降或缺失，細胞間的相互粘附力下降，造成細胞容易分散而向外浸潤性生長，一旦獲得轉移的條件，就可以脫離原發灶而發生轉移[1]。乳腺癌患者的E-Ca的喪失與腫瘤的浸潤性、低分化和預后差有關[2-3]。研究發現，將E-Ca的cDNA轉染具有浸潤性的惡性腫瘤細胞株，則可抑制后者的移動。

本組資料未發現E-Ca與患者淋巴結轉移及遠期預后的相關性，筆者認為E-Ca作為預測指標不理想。但其在浸潤性導管癌和小葉癌中的表達陽性率不同，可以在腫瘤分化比較差的情況下輔助鑒別診斷。

腫瘤的生長和轉移是一個依賴血管的過程。乳腺癌是典型的血管依賴性腫瘤。當腫瘤體積超過1 ～ 2 mm3時，維持其繼續生長有賴于新生血管的生成。研究發現，隨著腫瘤微血管密度的增加，腫瘤侵襲轉移等惡性潛能也明顯增加。Narita等[4]對100例乳腺癌患者進行多因素研究，分析其年齡、腫瘤大小、淋巴結受累狀況、雌激素受體、微血管、P53等9個因素與預后的關系，結果提示MVD在淋巴結陰性組中可獨立作為預后指標，但在淋巴結陽性組MVD與術后生存期無關。在無復發組中，MVD高低與淋巴結陽性和陰性患者術后長期生存都有良好的相關性。

本組實驗結果顯示MVD與生存狀態及生存期有關，MVD高患者容易出現復發和（或）轉移，生存期縮短。腫瘤組織內MVD可作為一種新的反映腫瘤微血管形成強度與侵襲性必然聯系的生物學指標，作為腫瘤轉移的預報因子，判斷預后。

本實驗還發現MVD的高低與E-Ca的表達有相關性，E-Ca蛋白表達降低，MVD增高，可能是由于細胞之間黏附性降低，新生血管容易長入的緣故。

3.2 組織蛋白酶D和nm23-H1

Ca-D是一種含天冬氨酸的蛋白酶，正常情況下存在于細胞溶酶體內，由雌激素誘導產生，具有直接消化細胞外間質或間接破壞基底膜的作用，也可發揮生長因子的作用。在蛋白質分解代謝和組織修復過程中可有少量分泌。臨床研究發現細胞生長失控時Ca-D分泌增加。這種異常分泌的蛋白酶是細胞內蛋白質衰老退化從而導致癌細胞浸潤和擴散的主要原因。

很多臨床研究者認為Ca-D可以獨立作為預后值[5-6]，在淋巴結陰性的患者組中腫瘤間質內Ca-D呈中等至強陽性時，瘤細胞核分裂數目較高，組織學分級低，無病期及總生存期短[7]。腫瘤浸潤性越強，間質反應越明顯，瘤細胞分泌生長因子刺激間質細胞表達Ca-D，降解結締組織，有利于腫瘤浸潤和轉移，但相反的意見認為，在腫瘤細胞不表達或弱表達、在間質中高表達可能提示預后較好[8]。

本組數據顯示組織蛋白酶D表達存在異質性，只有間質細胞Ca-D表達與淋巴結轉移、復發、生存期有關，高表達者淋巴結轉移率高、容易復發、生存期縮短。

nm23-H1是一種與惡性腫瘤轉移相關的基因，多數研究結果表明乳腺癌組織中nm23-H1基因蛋白表達水平降低將增加腫瘤細胞的轉移能力。本研究結果表明，59.5%的乳腺癌組織中nm23-H1基因表達較高，與國外文獻報道相近。nm23-H1基因低表達組患者的淋巴結轉移率為83.33%，復發率為76.67%，明顯高于nm23-H1蛋白高表達組（分別為54.55%和40.91%），nm23-H1蛋白表達水平與淋巴結轉移及腫瘤復發呈負相關，與生存期呈正相關[9-10]，而與患者的發病年齡、組織學分類、腫瘤大小無關。因此檢測nm23-H1基因表達可作為臨床預測乳腺癌淋巴結轉移趨勢的重要參考指標之一[11]。

筆者還發現，腫瘤細胞Ca-D與nm23-H1蛋白表達水平呈正相關，支持腫瘤間質內Ca-D表達增高作為預后不良的判斷指標。

腫瘤細胞的浸潤和轉移是一個涉及多步驟、多因素的復雜過程，通過本研究筆者認為在乳腺癌細胞浸潤、轉移過程中，E-鈣黏附蛋白表達下降，細胞之間的黏附性、間質內微血管密度增高。這些新生血管把腫瘤細胞和循環系統直接連接起來，使腫瘤細胞賴以生長的物質交換得以進行。此外新生血管還可以作為腫瘤轉移的通道，通過新生血管將原發癌細胞輸送到轉移靶器官。腫瘤細胞nm23-H1表達減弱，組織蛋白酶D分泌減弱，可能誘導間質細胞Ca-D合成增多，降解結締組織，有利于腫瘤浸潤和轉移。利用乳腺癌患者手術切除標本進行免疫組化標記nm23-H1、MVD和Ca-D有助于預后的判斷。

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