牛冷凍精液的應用研究進展

郝 鵬,王 紅,解廣勤,胡建宏＊,楊海濤,賈永宏

(1.陜西省家畜改良站,陜西涇陽 713702;2.西北農林科技大學動物科技學院 ,陜西 楊凌 712100; 3.武警陜西省總隊后勤部農副業基地,陜西西安 712200)

早在20世紀50年代左右,英國、丹麥、美國、日本等畜牧業發達國家普遍推行牛的人工授精技術。我國牛的人工授精技術于20世紀70年代在生產中得到普及推廣,對促進我國養牛業的發展發揮了重大作用。牛精液的冷凍保存在家畜冷凍精液研究中最為成功,尤其是目前所有的奶牛場均利用冷凍精液,通過人工授精技術繁育后代。雖然如此,我國牛冷凍精液的研究水平與國外同類研究相比比較落后,精子活率低于國外標準。本文就牛冷凍精液的發展歷程以及牛精液冷凍保護劑和評定指標等進行綜述,以期對牛冷凍精液的研究有所借鑒,進一步提高牛冷凍精液的質量。

1 牛冷凍精液的發展歷程

家畜精液冷凍保存最早可追溯到1776年,意大利人Spallanzanei首先發現自然界中的低溫物質(冰雪)可對人精子的活動狀態產生影響。1949年,科學家發現了甘油對雞精液的冷凍保護作用,促使精液的冷凍保存技術取得了較大進展。隨后Polge和Smith等[1]對牛羊精液進行了試驗,發現稀釋液中加入15%～20%的甘油,并以10℃/min的降溫速度由0℃緩慢降至-79℃時,精子存活率會有很大提高。

1950年,美國用經冷凍過的良種公牛精液給38頭母牛輸精,懷孕率為79%,并首次獲得來自冷凍精液的犢牛,這是家畜中最早利用冷凍精液進行人工授精獲得成功的報道。雖然后來人們又做了大量的輸精試驗,但受胎率很低。為了提高冷凍精液輸精時母牛的受胎率,Polge和Rowso等[2]通過改變精液的處理程序,極大地提高了精子的存活率和受胎率。冷凍—解凍后精子的復蘇率可達70%～80%,并用-79℃冷凍保存2 h至8 d后的精液給38頭母牛輸精,其中30頭受胎。Polge[3]以冷凍保存1～5周的精液輸精208頭母牛,平均受胎率達65%。從此以后,許多科學家就稀釋液配方、稀釋倍數和稀釋方法、甘油濃度、精液平衡溫度和時間、降溫速度以及解凍方法等精液冷凍的各個步驟進行了大量研究,致使冷凍精液的應用取得快速發展。精液的超低溫冷凍保存技術越來越受到各國的重視,許多國家相繼建立了牛、豬、羊及人類的精子庫。

2 牛精液冷凍保存的基本原理

精子具有受溫度變化直接影響其本身活動力和代謝能力的生物學特性[4]。精子保存在超低溫狀態下,其代謝活動完全受到抑制,生命以相對靜止狀態保持下來,一旦升溫又能復蘇而不失去受精能力。精子之所以能夠復蘇的關鍵在于精液在冷凍過程中,在冷凍劑的保護下,防止了精子水分冰晶化對精子的破壞,而盡可能形成玻璃化。

冰晶化是水在降溫過程中的一定溫度條件下,水分子重新按照幾何圖形排列形成冰晶的過程。冰晶改變了精子膜的溶質濃度和滲透壓,造成精子脫水,發生不可逆的化學毒害而死亡。冰晶化只有當溫度在0～-60℃溫度范圍內緩慢降溫時形成,降溫越慢冰晶越大,-15～-25℃形成冰晶最多。玻璃化的冰凍狀態是水在超低溫下,水分子仍然保持原來自然的一種無次序的排列狀態,形成玻璃樣的堅硬而均勻的冰結[5]。在此狀態下,精子不會發生細胞脫水,結構維持正常。為避免冷凍過程中精子發生冰晶化,必須盡快通過危險溫區,形成玻璃化凍結。該過程具有不穩定的可逆性,精液冷凍的降溫和升溫均應快速處理。

3 牛冷凍精液的冷凍保護劑

甘油作為稀釋液中常用的冷凍保護劑,一方面對精子有保護作用,另一方面又對精子具有損傷作用,因而新型抗凍劑的開發一直備受關注。昝林森等[6]研究證明,海藻糖和牛血清白蛋白單獨和配伍使用都能對凍后精子品質產生明顯影響;胡傳活等[7]探索了乳鐵蛋白在牛精液冷凍中的效果,發現乳鐵蛋白對精子凍后活力、運動性能、畸形率、頂體完整率及質膜完整性均沒有顯著影響。冷凍稀釋液充當精子載體的作用,包含很多能夠調節精子受精能力的因子,并為精子提供代謝物質的功能。因此,對精子稀釋液的組成物質以及精子與環境物質的作用關系,有必要進行更多研究。

由于使用動物冷凍保護劑可能導致疾病的傳播與病菌的感染,近年來科學家一直在探索使用植物冷凍保護劑。Moussa等[8]報道,以蛋黃中提取的低密度脂蛋白(LDL)代替卵黃冷凍牛精液,其效果比商業用的稀釋液好。Bucak等[9]研究了蛋氨酸、肌醇和肉堿對凍融后牛精子各種參數(活力、異常率、DNA的完整性和受胎率)和氧化應激指標(脂質過氧化、谷胱甘肽和總抗氧化能力水平)的作用。結果表明,在冷凍前添加抗氧化劑可以維持精子DNA的完整性,使其免受冷凍損傷。Tuncer等[10]研究了半胱氨酸和谷胱甘肽對凍融后牛精子氧化應激指標的影響。結果表明,半胱氨酸和谷胱甘肽對精子形態并沒有顯著的影響,但可以降低冷凍過程對精子DNA的損害。Ansari等[11]研究證明,在稀釋液中添加丁羥甲苯可以顯著提高牛精液活力、質膜完整性和生存能力。

Hu等[12,13]發現,牛冷凍精液稀釋液中添加維生素B12可以顯著提高精子活力、頂體完整率和質膜完整率,而添加LDL顯著增加線粒體活性、頂體完整、膜的完整性以及DNA完整性。為了提高精子的抗氧化能力,Hu等[14,15]在牛冷凍稀釋液中添加維生素,發現可以有效減少由冷凍-解凍造成的氧化應激,從而提高牛精子的凍后品質。同時表明,抗氧化體系中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)含量和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)對維持牛精子的活力和運動能力發揮重要作用。Hu等[16]檢測了海藻糖對牛精液質量和凍融后抗氧化活性的影響。結果證明,稀釋液中添加海藻糖可以降低由凍融引起的氧化應激,從而提高冷凍-解凍后的牛精液品質。

4 牛冷凍精液的質量檢測

目前已經有很多種方法檢測精子的質量,諸如精子活力、精子形態、精子存活時間等[4]。常規精液檢測主要包括精子形態、精子濃度和精子活力三個部分。計算機輔助精液分析(CASA)系統是近些年推出的利用計算機輔助精子運動圖像分析儀來檢測精子質量的技術。該系統操作簡單、客觀、快速、重復性好、準確性高,能分析與精子運動功能相關的多種參數。流式細胞儀是檢測精子質量的一種新的方法,與傳統的光學檢測或熒光顯微鏡染色技術相比,流式細胞儀檢測冷凍-解凍后精子的質量具有高通量、準確和簡便等特點。檢測指標比較全面,能夠充分反應精子的結構和功能狀態。當然,預測精子受精能力的最好評估手段是IVF試驗,即在體外條件下讓解凍后精子按一定的比例與卵母細胞共同孵育,檢查其第一極體排出率、2～4細胞發育率、囊胚和擴張囊胚發育率等指標,并建立這些指標與母牛不返情率之間的相關性。在評定凍后精子的受精能力時,通過這些指標的測定,對于預測使用冷凍精液人工授精后母牛的不返情率、受胎率等具有重要意義。精子各項質量指標之間具有很強的相關性,利用其相關性客觀準確的綜合評定凍后精子質量,可為牛冷凍精液的應用提供一定的依據。

雖然牛冷凍精液的研究相對比較成功,應用也比較廣泛,但一般的研究僅僅涉及不同稀釋液對精液冷凍質量的影響,來探求最好的冷凍稀釋液配方。關于稀釋液中不同成分提高精子活力的機理,影響精子凍后活力的基因與蛋白及其相互作用和表達的信號途徑等,相對研究較少,從而對其作用機理不甚清楚。特別是我國牛冷凍精液的研究水平與國外相比仍然存在較大差距,例如目前國內生產的細管凍精解凍后精子活率僅達到30%左右,遠遠低于國外活率達到50%的生產標準。因此,我們要進一步加大研究力度,建立精子低損傷冷凍技術,切實提高牛冷凍精液的質量水平。牛精液冷凍技術與人工授精、體外授精、性別控制等現代生物技術的有機結合,在新世紀必將對我國地方低產品種改良、保護優良種質資源以及大力發展畜牧業、提高人們的生活水平、拉動區域經濟騰飛等發揮巨大作用,具有廣闊的應用前景。

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