禽流感表位疫苗的研究進展

張文慧，錢愛東

(吉林農業大學，長春 130118)

禽流感(Avian influenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一種禽類的急性、烈性傳染病，除了可感染禽類外［1］，還可感染人、豬和馬等多種動物，被世界動物衛生組織(OIE)列為必須通報的疾病［2］。禽流感在世界各地暴發［3］，給養禽業造成了巨大的經濟損失。自從1997年，有了人感染禽流感并致死病例的報道［4－5］，H5N1亞型禽流感病毒被普遍認為極有可能是下一次禽流感大流行的罪魁禍首［6］，嚴重威脅著人類的生命安全。大多數研究學者認為研制有效的流感疫苗是預防禽流感發生與傳播的重要手段［7－11］。禽流感的疫苗研究主要有全病毒滅活疫苗、基因工程重組病毒滅活疫苗、基因工程亞單位疫苗、基因工程活載體疫苗、轉基因植物疫苗、反基因工程疫苗、抗獨特性抗體疫苗、表位疫苗等。

表位疫苗是近幾年發展起來的一種獨特疫苗，它是以抗原表位為基礎制備的疫苗。免疫細胞通常難以借助其表面受體識別整個抗原分子，而是識別抗原大分子上的一些特定的免疫活性基團并與其進行反應。抗原分子中這些負責和免疫細胞的抗原受體或抗體分子相結合，決定該抗原特異性的特殊化學基團稱為表位。抗原表位是T細胞抗原受體和B細胞抗原受體及抗體特異結合的基本單位，在免疫應答中，根據T、B細胞抗原受體所識別的抗原表位的不同，分別稱為T細胞表位和B細胞表位。文章就近年來禽流感表位疫苗的研究現狀進行綜述。

1 表位的篩選方法

目前研究報道的篩選表位疫苗候選表位的方法有單抗法、生物信息法、異源抗體對接法等。宋建領等［12］采用針對禽流感病毒M1蛋白的型特異性單克隆抗體，淘選M13噬菌體展示的12肽隨機肽庫。結果篩選到M1蛋白222～230位氨基酸(HPNSSARLR)序列構成了流感病毒型特異性表位。還有不少學者應用生物信息學的方法預測禽流感病毒的表位。王國戧等［13］應用免疫信息學的方法尋找不同來源的H5N1亞型禽流感病毒血凝素(HA)的共同抗原表位。從GenBank下載不同來源的H5N1亞型禽流感病毒血凝素(HA)的氨基酸序列，使用ClustalW1.83和SYFPEITHI生物學軟件進行分析，選擇和MHC I類分子結合比較強的抗原肽，有可能發展為H5N1亞型禽流感病毒表位疫苗，用來預防H5N1亞型禽流感。白靚等［14］使用生物信息學方法，對所下載序列進行預測與分析，獲得H7N7亞型禽流感病毒血凝素B細胞和Th細胞相關抗原表位。通過H7亞型禽流感病毒陽性血清，初步驗證所選表位抗原性。獲得了5個H7N7亞型禽流感病毒候選B細胞和Th細胞表位。王開艷等［15］用生物信息學方法預測H1N1亞型流感病毒血凝素T和B細胞相關抗原表位，獲得了三條候選Th和B細胞表位。梁瑾等［16］嘗試用異源抗體對接方法對流感病毒血凝素B細胞構象表位預測進行可行性分析，基于蛋白質相互作用界面的形狀互補理論，使用異源抗體的晶體結構同流感病毒血凝素的晶體結構進行剛性分子對接。李新生等［17］用禽流感病毒T細胞表位與體外重建雞MHC I類分子結合的方法鑒定篩選的抗原表位多肽。篩選出KILTIYSTV和LLLAIVSLV兩條禽流感病毒的候選表位。

2 表位疫苗的候選基因

禽流感病毒是負義的單鏈RNA病毒，基因組分為8 個節段，依次為 PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS。HA(血凝素)蛋白是流感病毒的主要保護性抗原，同時也是流感病毒抗原亞型分類的一個重要標記性抗原，可誘生保護性抗體及細胞免疫［18］，是當前流感疫苗的主要成分。目前禽流感疫苗的開發研制都主要是針對該蛋白的［19］。宋慧娟等［20］對禽流感病毒HA模擬表位的研究與性質的分析及類病毒顆粒融合蛋白的表達與活性分析、免疫原性分析，都為研制禽流感表位疫苗奠定了基礎。

NA(神經氨酸酶)是流感病毒表面的另一類糖蛋白，其數量沒有HA多，能促使被感染細胞釋放出新產生的病毒顆粒，是流感病毒繼續擴散和繁殖必不可少的。有的表位疫苗設計是針對NA蛋白的［21］。

在流感病毒的各個基因中，NP基因最保守，具有型特異性，根據其抗原性的不同，可將流感病毒分為A、B、C三個型。M的氨基酸序列很保守，在所有的禽流感病毒中，其序列幾乎完全相同。針對NP和M蛋白設計的表位疫苗可以在不同亞型的禽流感病毒間通用。Guus F等［22］認為當禽流感疫情暴發體液免疫抵抗流感病毒是不夠的，因此選擇高度保守的M和NP蛋白的細胞毒性T細胞(CTL)表位是非常必要的。鄧路瑤等［23］在A型流感病毒M1蛋白中找到了保守且有很強免疫原性的T細胞表位，并成功插入沙門氏茵SEF17茵毛基因agfA中。Bodewesa等［24］篩選出了 NP383～391一段9肽序列的CTL細胞表位。

僅針對禽流感病毒的單個抗原基因設計的表位疫苗，雖然也能誘導機體產生保護性免疫應答，但忽略了禽流感病毒的其他抗原成分。多表位疫苗是將禽流感病毒抗原基因中的抗原活性部位(包括B細胞表位和T細胞表位)串聯在一起并插入真核表達質粒中構建而成的，避免了將多個抗原基因克隆入同一載體的困難以及可能引起的轉錄干擾問題［25］，而且不必構建多個單一質粒進行混合免疫就可充分發揮病原體中各個抗原成分的作用。Pushko等［26］將HA、NA和 M1蛋白的部分表位組合到一起，設計多表位疫苗。陳義鋒等［27］篩選流感病毒主要抗原(HA、NA、NP、M)表位基因，以生物信息學軟件優化其排列結構，合成流感通用的復合多表位基因，構建抗A型流感H3、H5、H7、H9亞型的重組質粒，將其轉染幼倉鼠腎細胞(BHK細胞)，檢測到有效地轉錄和表達;而且其表達產物均能與相應的抗體特異性結合，證明了其具有一定的生物學活性和抗原性，有望成為抗多種A型流感病毒的通用表位疫苗。

3 表位疫苗的免疫效果

Pushko等［26］將針對禽流感病毒 HA、NA和M1蛋白的部分表位設計的多表位疫苗免疫BALB/c小鼠，具有良好的免疫效果。李新生等［28］對體外鑒定的禽流感病毒T細胞表位的免疫效果進行了研究。將來源于禽流感病毒的、可與雞MHC I類分子結合的KILTIYSTV和LLLAIVSLV多肽免疫BALB/c小鼠，免疫后IFN－7的分泌量顯著增長，能引起CD8+T淋巴細胞的額外增殖，刺激小鼠產生特異性CTL反應。賈雷立等［29］以流感病毒的主要抗原(NP、NA、M)表位的基因為基礎，設計并合成大小為765 bp的復合多表位基因盒，并克隆入真核表達載體，構建的重組體對BALB/c小鼠進行免疫接種后，檢測體液與細胞免疫指標，具有良好的免疫原性。彭金美等［30］以H5N1亞型禽流感病毒的HA和NP基因及其表位為基礎構建了4個重組質粒，分別肌注免疫30日齡SPF雞，能夠誘導機體產生特異性免疫應答，并在同型禽流感強毒攻擊時對雞提供了一定的保護。Shi－gui Yang等［31］構建的表位疫苗重組體VPR－VP22/HA和VPR－HA都具有良好的免疫效果，有望成為預防禽流感的表位疫苗。

4 表位疫苗研究的展望

通過眾多研究學者們對禽流感表位疫苗的研究，筆者認為設計、研究由禽流感病毒多種抗原表位組成的多表位疫苗則能更有效的預防各種亞型禽流感的暴發。抗原表位是機體免疫系統識別抗原的主要化學基團，其氨基酸序列較短。抗原表位既能夠有效地被免疫系統識別、遞呈，又能誘發機體產生特異性的體液免疫和細胞免疫。而且可通過選擇多個具有交叉保護性的抗原表位來預防多種亞型禽流感病毒毒株。同時較短的序列很容易合成，對載體的克隆能力要求較低，易于在載體中插人多個表位構建基因工程多表位疫苗。因此表位疫苗作為一種新型的抗禽流感疫苗，具有很好的發展前景。

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