海洋微生物活性胞外多糖的研究進展

孫海紅,毛文君,錢葉苗,宋相麗

(1.海洋化工研究院,山東 青島 266071; 2.中國海洋大學醫藥學院,山東 青島 266003)

海洋是生命資源的寶庫,地球上的生物 80%存在于海洋,海洋生物物種遠比陸地生物豐富和復雜。海洋微生物是海洋生物的重要組成部分,是重要的海洋自然資源。近些年來,海洋微生物胞外多糖獨特的化學結構和生物活性研究在海洋生態學、微生物學特別是藥學領域受到廣泛關注[1],海洋微生物胞外多糖的結構及生物活性研究取得了顯著進展。

海洋微生物種類數量繁多,據統計有 100 萬～2 億種,在正常海水中的數量一般為 106/mL,海洋微生物處于低溫、高鹽、高壓、寡營養、高溫度梯度及高毒性濃度的特殊環境,具有產生結構新穎、功能獨特的新型活性多糖的潛力,是開發多糖類海洋新藥的重要資源。幾十年來,已有很多關于海洋微生物代謝產物的研究文獻,但研究目標還主要局限于脂溶性小分子化合物的代謝產物,而關于海洋微生物胞外多糖的研究鮮見報道。其生物多樣性遠遠超過陸地生物的多樣性,遺傳及生理特性與陸地微生物有所不同,且相當部分海洋生物活性物質是陸地生物所沒有的[3],因此從海洋微生物尋找各種生物活性的多糖及多糖復合物,是近年來海洋藥物研究的熱點。

研究表明,海洋微生物胞外多糖大多是由多種單糖按照一定比例組成的雜多糖,其中葡萄糖、半乳糖和甘露糖最為常見,另外還含有葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基糖和丙酮酸等。結構的多樣化使得海洋微生物胞外多糖具有許多特殊的理化特性,在醫藥、化工等領域具有廣闊應用前景。目前,海洋微生物多糖的研究主要集中在海洋細菌多糖和海洋真菌多糖,而對海洋放線菌多糖鮮有報道。海洋細菌和海洋真菌作為海洋微生物的一個重要組成部分,能產生許多具有生物活性的胞外多糖,一些細菌和真菌多糖已經被證明具有抗腫瘤、免疫調節和抗氧化活性。本文對海洋微生物來源的胞外多糖的研究概況進行系統的綜述。

1 海洋細菌產生的胞外多糖

細菌的胞外多糖包括革蘭氏陰性菌細胞膜外的多糖成分以及革蘭氏陽性菌的肽聚糖。

1.1 海洋細菌胞外多糖的結構研究

早在1983年,Boyle等[4]對源于兩種潮間帶細菌的胞外多糖進行了研究,發現兩者均由葡萄糖、半乳糖和甘露糖構成,后者還含有丙酮酸。源自海洋沉積物的海洋假單胞菌能產生一種由葡萄糖、N-乙酞葡萄糖胺和 N-乙酞半乳糖胺構成的胞外多糖,可以抑制蛋白質合成和增加黏附能力,從而保證該菌在惡劣條件下也可以生存。同年,日本的 Umezawa 等[5]從海水、海泥和海草中分離出1083 株海洋細菌,并從中得到一種新的雜多糖Marinactin,是由葡萄糖、甘露糖和巖藻糖按 7：2：1 的比例組成。

Okutaani等[6]從一種名叫MU-3海洋細菌中分離出一種酸性胞外多糖。結構分析表明該多糖含有一個支鏈結構。其主鏈為-3)-β-Galp(1→3)-α-D-Galp(1→6)-β-D-Glcp(1→側鏈為α-D-Galp(1→4)--D-Glcu(1→。葡萄糖糖醛酸通過C4連在支鏈上,而β-D-半乳糖殘基在主鏈,末端的半乳糖在側鏈的C6,C4有乙酰基取代基。

Nicolaus等[7]研究了分離自意大利淺海熱泉的嗜熱海洋細菌產生的胞外多糖,這些多糖具有復雜的初級結構和不同的重復單元,提取胞外多糖的分子質量是3.8×105u,由甘露糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖胺以 1：0.1：trace：trace 的比例構成八糖重復單元。另一胞外多糖的分子質量是1.0×106u,單糖組成為半乳糖、甘露糖、氨基葡萄糖和阿拉伯糖,比例是 1：0.8：0.4：0.2。嗜熱菌Bacillus thermantarcticus產生兩種胞外多糖 EPS1和 EPS2。其中 EPS1是由4種不同的α-D-甘露糖和3種不同的β-D-葡萄糖構成的具有重復單元的結構的雜多糖,類似于黃原膠。EPS2是由4種不同的α-D-甘露糖構成的甘露聚糖,還含有微量的丙酮酸,分子質量為3.0×105u[8]。

20世紀90年代開始,隨著深海探測技術的發展,對深海熱泉微生物的研究成為可能。Raguenes[9]從深海水流中分離得到一種嗜溫異氧細菌 ST716,這種細菌在葡萄糖的培養基中分泌出一種不同尋常的大分子質量的多糖,該多糖含有葡萄糖、甘露糖、丙酮酸酸化的甘露糖、半乳糖及半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。Rougeaux 研究小組研究了5種從深海分離得海洋細菌分泌的胞外聚合物,根據它們的化學組成和流變學性質說明有 4種不同的多糖,由可變單孢菌Macleodii subsp.fijiensis分泌的多糖與一種商業多糖黃原多糖相似,3種假可變單孢菌中的兩種產生了相同的多糖。除屬于弧菌gonus細菌產生的多糖含有一種醛酸己糖胺外,都含有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸[10]。從East Pacific Rise深海熱泉提取的由PseudoalteromonasHYD 721產生的胞外多糖的組成和結構,研究表明,此胞外多糖由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖和葡萄糖醛酸以2：2：2：0.8：1 的比例組成。通過甲基化、β-消除、選擇性降解糖醛酸、部分降解和 NMR等方法分析,表明它是由一個支鏈化的8糖重復單元構成[11]。

1.2 海洋細菌胞外多糖的活性研究

1.2.1 抗腫瘤活性

日本 Umezawa等[5]對從培養液中分離出的 167株海洋細菌產生的胞外多糖,進行抗腫瘤活性篩選,有6%的多糖有明顯的抗S180活性。雜多糖Marinactin具有顯著抗小鼠 S180實體瘤活性,抑制率達79%～90%,并已在日本作為治療腫瘤的佐劑上市。Marinactin 對攜帶各種哺乳動物腫瘤的小鼠,能延長壽命,顯著增加脾臟抗體形成細胞和遲緩型超敏性。此外,在體外它能刺激淋巴細胞的轉化作用,活化巨噬細胞[12]。

Rashida 等[13]對一株海綿共附細菌Celtodoryx girardae胞外多糖EPS對單純皰疹病(HSV-1)有抑制作用。另有報道,從海洋弧菌屬提取的胞外多糖具有抗腫瘤活性。小鼠試驗糖對白血病 P388和肉瘤 S180細胞均有一定的抗性; 另外,該糖還能降低細胞對植物凝集素的免疫反應。2006年Arena等[14]研究了分離自意大利 Vulcano島淺海熱泉的耐熱菌株Bacillus licheniformis產生的胞外多糖 EPS-1,發現EPS-1可以削弱人體外圍血液單核細胞(PBMC)中HSV-2的復制,但在細胞中沒有此作用。這些數據證實了海洋中存在著大量的獨特的微生物資源,顯示了其作為抗腫瘤藥物的開發前景,增強了人們從海洋微生物胞外多糖的研究尋找具有獨特結構、高活性的多糖的信心。

1.2.2 免疫調節活性

蘇文金等對分離自廈門海域 177 株細菌研究表明,胞外粗多糖產量高于3 g/L 占2.26%,高于2 g/L占 3.95%,并從中篩選到能產生具有顯著免疫調節活性多糖的微生物[15]。

1.2.3 抗氧化活性

郭守東等[16]從愛德華氏細菌Edwardsiella tarda分離得到兩種甘露聚糖 ETW1和 ETW2,其分子質量分別為29.0 ku和70.0 ku。結構分析表明ETW1和 ETW2二者均是以[→3)-α-D-Manp(1→]為主鏈的7糖重復單元組成的甘露聚糖,抗氧化活性表明低分子質量多糖的抗氧化活性更強,ETW1和ETW2清除OH·的EC50分別為1.13 g/L和1.52 g/L。

1.2.4 其他活性

Lee[17]報道,從濟州島海洋沉積物中分離到的細菌產生一種胞外多糖,分子質量大于2 000 ku,由半乳糖、葡萄糖、木糖和核糖構成,具有良好的乳化性,可用作乳化劑。海洋生物附著弧菌Vibrio alginolyicus產生的胞外多糖由葡萄糖、氨基阿拉伯糖、氨基核糖和木糖構成,分子量為 6390 ku,其溶液具有較好的流變性,但對高溫和強堿不穩定[18]。

孟飛飛等[19]從連云港臺南鹽場采集藻墊,在去除底泥等雜物的藻類層中分離出 5 株不同的細菌(編號為A,B,C,D和E),實驗結果顯示細菌胞外多糖是構成鹽田藻墊膠質的重要組成部分,藻墊核心層細菌 EPS沒有絮凝活性,不能通過絮凝作用促進藻墊形成,而具有乳化活性的 EPS 能夠使藻細胞表面的疏水性下降,從而使藻細胞的黏附性下降,因而使藻細胞易從固著物上分離[20]。

2 海洋真菌產生的胞外多糖

2.1 海洋真菌胞外多糖的結構研究

海洋真菌是海洋微生物的一個重要分支,胡谷平等[21]首次從南海海洋紅樹林真菌(1356號)的菌體中分離純化出兩種新型多糖W11和W21,W11主要是由葡萄糖和半乳糖的摩爾比按3：2比例組成; 胞外多糖 W21主要由葡萄糖、半乳糖還含有少量木糖組成,摩爾比為 45：3.6：1.0,相對分子質量為 3.4×104,糖酸酸含量為35.12%。從南海海洋紅樹林內生真菌菌體中分離得到一種胞外多糖(分子質量 34 ku),主要由葡萄糖、半乳糖和少量木糖組成,還含有35.12%的葡萄糖醛酸[22]。

孫海紅等[23]從深海真菌Penicilliumsp.F23-2中提取純化得胞外多糖LEPS1-1、LEPS1-2、LEPS-2,結構分析結果表明 3種胞外多糖均以甘露糖含量為最高,同時含有少量或微量的葡萄糖和半乳糖。同時推斷LEPS1-1和LEPS1-2和LEPS-2中存在大量的α-D-甘露吡喃糖,并含有少量的β構型葡萄糖糖苷鍵。陳東淼等[24]從海洋真菌2560號里面分離得到一種新的多糖A2,由巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖以及半乳糖組成,它們的摩爾比分別為 2：2：17：5：2。

中山大學組曾把2508號真菌的菌體作為多糖的來源,從該菌體中分離到一種新的多糖G-22a,并通過酸水解的方法對該多糖的單糖組分進行了研究。GC /MS研究表明G-22a由鼠李糖、甘露糖和葡萄糖及少量的木糖、核糖醇組成。鼠李糖/甘露糖/葡萄糖的質量比約為1：1：2,還含有少量的木糖和核糖醇。

2.2 海洋真菌胞外多糖的活性研究

文獻表明[25-28]：真菌多糖具有免疫調節作用,免疫調節是大多數活性多糖的共性,也是它們發揮抗腫瘤作用的基礎。真菌多糖并不能直接殺死腫瘤細胞,但卻可以刺激機體免疫能力,從而達到抑制腫瘤細胞增生的目的。

2.2.1 免疫調節活性

體外細胞毒試驗顯示從南海海洋紅樹林真菌(1356號)的菌體中分離純化出的 W21的 HepG2和Bel7402半數殺傷濃度(IC50)分別為 50 mg/L和 25 mg/L,有一定的細胞毒作用。體內抑瘤試驗顯示W21與環磷酰胺合用,可提高環磷酰胺的抑瘤率,提高機體的免疫作用[21]。

2.2.2 抗氧化活性

Yang[29,30]等從中國黃海沉積物中分離到的絲狀真菌PhomaherbarumYS4108獲得胞外多糖 EPS2,平均分子質量為130 ku,由半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖和葡萄糖醛酸構成,并具有很強的抗氧化活性。

從深海真菌Penicilliumsp.F23-2中提取純化獲得的 3種胞外多糖均表現出了很強的清除羥基自由基、超氧陰離子自由基的能力和抗脂質過氧化,并具有一定的還原能力和清除 DPPH自由基的能力,其中胞外多糖LEPS-2表現出了特別顯著的抗氧化能力[23]。

Sun等[31]研究了海洋絲狀真菌胞外多糖EPS2的清除自由基和抗氧化活性。體外實驗顯示,EPS2對超氧自由基和羥基自由基具有顯著的清除活性,對人低密度脂蛋白(LDL)的銅催化氧化反應具有劑量依賴性抑制作用,并報道了 EPS2在 H2O2中對小鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞的保護作用[32]。

3 海洋放線菌產生的胞外多糖

海洋放線菌作為一類特殊的、具有重要經濟價值的微生物,最早報道成功分離海洋放線菌的例子為1975 年日本東京大學微生物所Okami 小組從相模海灣(Sagami Bay)沉積物中分離出能產抗生素的放線菌Chainia puropurogenaSS-228[33]。對海洋放線菌的次級代謝產物的研究多集中在脂溶性小分子天然產物方向,考慮到在過去的幾十年中從陸地放線菌中分離到大量的具有重要生物活性的糖類化合物,因此從海洋環境中分離和篩選放線菌以得到生物活性高的糖類物質是很有必要的。目前,關于海洋放線菌多糖的結構研究國內外很少見報道,主要集中在對其活性的研究,研究表明海洋微生物胞外多糖具有免疫調節、抗菌和抗氧化等生物活性。

3.1 免疫調節活性

蘇文金等[34]對分離于廈門海區潮間帶的 996株海洋放線菌胞外多糖產量和體內外免疫活性進行了評價。結果表明,3.3%的海洋放線菌粗多糖產量大于3 g/dm3; 在粗多糖產量高的海洋放線菌中有 3株菌株的胞外多糖在體內外均具有較好的免疫增強活性,其中鏈霉菌(Streptornyceasp.)23～35菌株的胞外多糖具有較高的非特異性、細胞及體液免疫增強活性。蔡慧農等[35]以鏈霉菌2305菌株作為發酵菌種,建立和優化了胞外多糖搖瓶發酵培養基配方、發酵工藝及發酵條件,胞外多糖產量達到4.58 g/L,轉化率達到6.90%。為該海洋放線菌胞外多糖的大量獲取并對其作進一步的結構、活性方面的研究提供了便利,也為該胞外多糖的工業化發酵生產提供了必要的基礎。

3.2 抗菌活性

岡見吉郎從日本Tenjin 島的近海泥中分離到一株放線菌,其菌絲呈淺藍色,Pridhan -Gottlieh’s 基礎培養基里能利用葡萄糖和肌醇作為唯一的碳源。在含海水的培養基里進行振蕩培養,能產生抗菌物質[36]。

3.3 抗氧化活性

作者最近從海洋放線菌THW-7A發酵液中分離鑒定出兩種胞外多糖WEPS-1和WEPS-2。結構分析結果表明：WEPS-1的主鏈主要為1→2Man、1→3Man和 1→2,3Man,并且摩爾比近似等于 5：5：3。而WEPS-2 主鏈主要是 1→2Man、1→6Glc、1→3Glc、1→2,3Man和 1→3,6Man?？寡趸钚匝芯勘砻鳎篧EPS-1和WEPS-2對清除超氧陰離子和抗脂質過氧化的能力異常顯著,WEPS-1和WEPS-2清除 O2-·的EC50分別為1.13 g/L和0.59 g/L,抗脂質過氧化能力測試中的EC50分別為0.58 g/L和0.43 g/L。

海洋放線菌雖然不是海洋微生物生態系統中的主要組成部分,但海洋放線菌的多樣性及其代謝產物的獨特性,暗示了開發海洋放線菌的巨大潛力,也越來越引起科學家的重視。

4 展望

目前,屬我國管轄的海域約300萬km2,有大小島嶼 6 000多個,地理條件差異大,溫度相差懸殊,有著極其豐富的海洋微生物資源,充分利用我國海洋微生物的資源優勢,研究開發具有我國自主知識產權的海洋微生物胞外多糖,不僅具有必要性,而且具有美好的產業化前景。近年來,國內外科學工作者對海洋微生物來源的次級代謝產物胞外多糖的興趣激增。但就世界范圍來說,由于對海洋微生物的生物學和生物化學知識仍然很缺乏,相當數量的細菌、真菌和放線菌還沒有被認識和分離,但從已獲得的研究結果表明,海洋微生物胞外多糖的研究取得了重大進展。建立了一系列活性多糖的提取、純化方法、生物活性測試方法、結構分析方法,發現了許多具有重要生理活性的胞外多糖,研究的廣度和深度在不斷發展。綜上所述,海洋里生存繁衍著許許多多新種屬的微生物和特殊生態系統的微生物,這些海洋微生物有產生多種結構新穎的生物活性物質多糖的巨大潛力,必將成為人類開發新藥的重要寶庫之一。

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