尾加壓素Ⅱ在大鼠心肌纖維化中的表達及作用

徐為民,曹 振,蘇 青,高長斌*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 老年病科,吉林長春 130033;2.長春市口腔醫院,吉林 長春 130022;3.吉林大學藥學院實驗藥理與毒理教研室,吉林長春 130021）

心肌纖維化(myocardial fibrosis,MF）系指在正常心肌組織中膠原纖維(心肌細胞外基質主要成分）大量積聚,膠原濃度明顯升高或膠原成分發生改變[1]。研究表明:MF是多種心臟疾病發展到一定階段的共同病理改變,是心血管系統疾病的獨立危險因素[2]。尾加壓素(urotensin,UII）是迄今所知最強的縮血管活性肽,其縮血管作用較內皮素高10倍以上[3]。體外研究中發現尾加壓素Ⅱ可促進心肌成纖維細胞增殖并促進Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維聯結蛋白表達,提示尾加壓素Ⅱ在心肌纖維化過程中可能發揮重要作用[4,5],然而體內研究鮮有報道。本實驗通過注射鹽酸異丙腎上腺素(isoproterenol,Iso）復制大鼠心肌纖維化模型,從基因和蛋白表達水平研究UII在大鼠心肌纖維化中的表達情況,以進一步探討其在MF的發生發展關系。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器鹽酸異丙腎上腺素注射液(由上海禾豐制藥有限公司生產,Iso）;羊抗大鼠UII單克隆抗體(由santa cruz公司提供）;SP-9000免疫細胞化學試劑盒(由北京中衫金橋生物技術有限公司提供）。

1.2 實驗動物及分組雄性Wistar大鼠20只,體重180-220 g,由吉林大學實驗動物中心提供。分為正常對照組及Iso組(包括12 h、1周及3周組）。

1.3 Masson三色染色評估細胞外基質含量細胞外基質經染色后表現為蘭色,病理圖像分析系統分析陽性信號吸光度(A）。

1.4 UII蛋白組織化學染色嚴格按SP-9000免疫細胞化學試劑盒說明進行實驗。染色后在每張切片左心室尖部,隨機選取5個高倍鏡視野(×200）,用病理圖像分析系統對所選視野內陽性信號進行圖像分析,計算不同時間點的各組大鼠心肌組織陽性信號吸光度(A）。

1.5 半定量RT-PCR檢測UII mRNA表達GAPDH內參基因上游5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3',下游5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3';UII:Sense:5'-TGC CTG CTC TTC GTA GGA CT-3'Anti-sense:5'-AGA GCC TTC CTC AAG CTT CC-3',擴增產物長度分別為452 bp和603 bp。UII表達量以UII與GAPDH吸光度(A）之比來表示。

1.6 統計學處理采用SPSS11.5軟件進行統計學分析。UII的表達量用ˉx±s表示,組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 HE染色組織學變化

正常大鼠心肌纖維排列整齊,胞核明顯,無細胞腫脹。注射Iso 12 h后,心肌出現散在壞死灶,局限于心內膜下。1周后,出現界限清晰、多發壞死灶,心肌可見一定的膠原纖維。3周后,壞死病灶可見明顯纖維化。

2.2 Masson三色染色細胞外基質經染色后表現為蘭色。正常對照組心肌細胞外基質含量較少;注射Iso 1 W后,含量即明顯增加(P＜0.01）。3周最為明顯,圖像分析結果見表1。

表1 心肌組織中膠原、UII基因和蛋白表達

2.3 UII免疫組織化學染色UII免疫組織化學染色結果顯示:正常對照組在心尖及心內膜可見極少量陽性表達細胞。注射Iso 12 h后,UII陽性表達產物即有所增加。注射1周后,UII陽性產物增加明顯,呈黃褐色(P＜0.01）。注射3周后,UII陽性產物呈黃褐色,且表達明顯比1周多(P＜0.01）且多分布在壞死灶周圍,結果見表1及圖1。

圖1 UII免疫染色結果(×200）

2.4 UII mRNA表達情況RT-PCR結果顯示,注射Iso 12 h后,UII mRNA表達最為明顯,1周有所下降但仍高于正常對照組(P＜0.01）,3周后仍未恢復到正常水平(P＜0.05）。見表1及圖2。

圖2 UII mRNA在心肌組織中的表達

3 討論

UII是在哺乳動物體內發現的生長抑素樣環肽,是繼ET-1之后又一新的強力縮血管活性肽,其分布具有種屬普遍性,UII及受體主要分布在神經系統、心血管和腎臟等組織[5]。除縮血管活性外,UII還是一種強烈的內源性絲裂原,能夠促進血管平滑肌細胞、內皮細胞、心臟成纖維細胞和氣道平滑肌細胞等多種細胞的增殖,從而加速疾病的發生和發展[6]。多項體外研究顯示尾加壓素Ⅱ可促進心肌成纖維細胞增殖膠原表達,并且該增殖作用可被UII受體拮抗劑SB2611812完全阻斷,并且該受體阻斷劑治療冠狀動脈結扎后心肌重塑大鼠8周后,心肌纖維性膠原沉積明顯減少[7],由此我們認為,UII極有可能參與心肌纖維化的發病過程。

為進一步驗證,本實驗采用多點皮下注射Iso復制大鼠缺血缺氧性心肌壞死模型,重點觀察壞死灶與纖維灶UII表達水平。造模后的動物注射Iso 12 h后即出現點狀壞死,隨時間的延長缺血壞死面積明顯增加,3周時已出現明顯的纖維化。本實驗應用免疫組織化學及RT-PCR方法,對Iso所致MF發生發展過程中UII蛋白表達水平及mRNA表達水平進行了觀察。結果表明:多點皮下注射Iso后12 h UII mRNA及蛋白表達即增高,特別是mRNA,且這種增高明顯早于纖維化的發生。盡管UII mRNA的表達于1周逐漸下降,但3周后仍未恢復到正常水平,而且UII蛋白表達水平仍然隨著纖維化程度的加重穩步增高,提示UII可能參與大鼠MF發生及發展過程。UII的促纖維化作用可能與轉化生長因子-β(transforming growth factor beta1,TGF-β1）有關,研究顯示尾加壓素 Ⅱ能夠促進TGF-β1表達,而TGF-β1抗體能抑制UⅡ對體外培養的心肌成纖維細胞的促膠原合成作用[8],其具體機制還有待進一步探討。

[1]高海成,任立群,于曉艷,等.AT1R在心肌纖維化中的表達及意義[J].中華病理學雜志,2008,37(10）:687.

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[8]Dai HY,Kang WQ,Wang X,et al.The involvement of transforming growth factor-β1 secretion in urotensin Ⅱ-induced collagen synthesis in neonatal cardiac fibroblasts[J].Regul Pept,2007,140:88.