用微柱凝膠法診斷新生兒溶血病的實驗研究

王宇宏,劉 冰

(1.吉林省婦幼保健院 檢驗科,吉林 長春 130051;2.吉林大學第一醫院 輸血科,吉林 長春 130021）

新生兒溶血病(Hemolytic disease of newborn,HDN）最基本的病因是胎母血型不合的胎兒紅細胞進入母體,刺激母體產生IgG類免疫性抗體,該類抗體能通過胎盤與胎兒紅細胞結合并使之破壞而發生溶血,常可導致新生兒黃疸、貧血、水腫等,嚴重者將造成新生兒生理缺陷甚至死亡[1]。HDN主要包括ABO血型及Rh血型等溶血病,但又以ABO血型不合HDN最為常見,其次為Rh血型系統,其他血型系統導致的HDN較為少見[2,3],我國有研究表明ABOHDN占新生兒溶血病的85.8%[3]。HDN血清學檢測的“3項試驗”:直接抗人球蛋白試驗、游離抗體試驗和抗體釋放試驗對該病的診斷最具有價值,目前臨床常用傳統的試管抗人球蛋白試驗(Coombs試驗）進行檢測,操作步驟多、時間長、結果不便于保存,作者對近年我院送檢的79例ABO-HDN患兒血液標本以國產微柱凝膠試劑卡進行3項試驗的檢測,現將統計分析后的結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 臨床標本我院送檢的疑似ABO-HDN的新生兒外周血標本79例,患兒以黃疸或進行性黃疸加重為主要癥狀,年齡為出生24 h內至7天,其中61例為出生小于或等于5天的新生兒的標本,18例為出生超過5天的標本。79例標本中男性42例、女性37例,患兒均為A型或B型,與其母均為ABO血型不合,母均為O型RhD陽性。

1.2 試劑儀器微柱凝膠法新生兒溶血病檢測卡Ⅰ(ABO、RhD血型復查,直接抗人球蛋白試驗）、微柱凝膠法新生兒溶血病檢測卡 П(游離抗體試驗、抗體釋放試驗）、ABO標準紅細胞(0.8%）,以上均由長春博迅生物技術有限責任公司生產;微柱凝膠免疫分析技術專用離心機和孵育器由長春博研醫學生物儀器公司生產。

1.3 檢測方法

1.3.1 血型復查及直接抗人球蛋白試驗 取新生兒溶血病檢測卡Ⅰ(1-6管）加患兒0.8%紅細胞懸液 50 μ l,專用離心機離心5 min(900 rpm,2 min,1 500 rpm,3 min）,離心后觀察結果,以凝集紅細胞停留在膠表面或膠中為陽性。

1.3.2 游離抗體試驗及抗體釋放試驗 取新生兒溶血病檢測卡 П,將1-3管分別標記為A細胞、B細胞、O細胞,將4-6管分別標記為A細胞、B細胞、O細胞。游離抗體試驗將患兒血清50μ l分別加入前3管;抗體釋放試驗將患兒放散液50μ l分別加入后3管,患兒紅細胞放散液按文獻[4]制備。按標記分別將0.8%A細胞、B細胞、O細胞懸液各50 μ l加入1-6管,置專用孵育器內37℃孵育15 min,再放入專用離心機內離心5 min(900 rpm,2 min,1 500 r/min,3 min）,離心后觀察,陽性結果判斷標準同上。

1.3.3 通過新生兒溶血病3項試驗判斷ABO-HDN的方法[5]直抗試驗以出現凝集為陽性,游離和放散試驗以檢出可以和新生兒紅細胞反應的抗體為陽性;單項放散試驗陽性及其他項目陽性同時合并放散試驗陽性的結果均可判為ABO-HDN;直抗及游離試驗1項陽性只能判定為ABO-HDN可疑陽性,兩者同時陽性可判為ABO-HDN。

1.3.4 統計學處理 陽性率差異分析采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 79例疑似ABO-HDN樣本3項試驗結果3項試驗檢測陽性結果見表1。3項試驗不同陽性的分布及結果判斷見表2,由表2結果中可見ABOHDN確診數為70例,陽性率88.61%,且確診病例抗體釋放試驗均為陽性。

表1 79例樣本3項試驗檢測陽性結果

表2 79例樣本3項試驗不同陽性的分布及結果判斷

2.2 確診樣本中ABO血型分布及檢出抗體特異性結果見表3。確診ABO-HDN 70例,其中母-嬰血型O-A 者為33例,占47.14%,O-B者為37例,占52.86%,兩組比較差異無統計學意義(χ2=0.46,P＞0.05）。

2.3 ABO-HDN陽性率與新生兒出生天數的關系結果見表4。出生天數小于或等于5天新生兒共61例,ABO-HDN的陽性率為95.08%,明顯高于出生天數大于5天者(共18例）的66.67%,具有統計學意義(χ2=8.48,P＜0.01）。

表3 確診樣本中ABO血型分布及檢出抗體特異性

表4 ABO-HDN陽性率與新生兒出生天數的關系

3 討論

我國漢族HDN絕大多數由ABO血型系統抗體引起,其中最多見的是母親為O型,胎兒為A型或B型。理論上母親A型,胎兒B型或AB型或母親B型,胎兒A型或AB型時也可以發病,但實際病例很少。關于A/B血型的發病率各地報道不一,與地區血型基因頻率分布不同有關,也可由A/B抗原性強弱不同所致[6,7]。本研究結果顯示,在確診的70例ABO-HDN中,B型占52.86%,A型占47.14%,兩者差異無統計學意義(P＞0.05）,與文獻[8]報道相符。B型分布略高于A型,與本地區(吉林省）ABO血型分布(A型25.18%,B型33.18%）規律相一致[9]。

新生兒ABO-HDN的確診依賴于血清學3項檢查[10]。直抗試驗是檢查患兒紅細胞是否致敏了不完全抗體,但在ABO-HDN此項試驗常反應微弱甚至無法檢出[3],本研究結果直抗試驗陽性率僅為35.44%,在3項試驗中陽性率最低。考慮與ABO血型抗原在新生兒紅細胞膜上發育不完全,紅細胞上A、B抗原相對較少有關。游離抗體試驗是檢測患兒血清中的游離抗體,該試驗陽性提示繼續溶血的可能,本檢測結果該試驗陽性率為78.48%,但因游離抗體只在出生后頭幾天存在,以后迅速消失,因此對晚期診斷意義不大,且如僅游離抗體陽性只表明患兒體內有抗體而不一定致敏,不能據此確診[3]。而抗體釋放試驗是從患兒紅細胞上釋放出抗體,與成人相同血型的紅細胞反應,陽性則提示存在溶血,本研究顯示該試驗陽性率達到88.61%,遠高于其他2項檢查。另外,本研究中79例樣本3項試驗不同陽性的分布及結果判斷顯示,3項試驗均陽性的為23例(占29.11%）,游離試驗陰性同時直抗試驗與釋放試驗陽性的5例(占6.33%）,單項釋放試驗陽性的3例(占3.80%）,值得注意的是ABO-HDN患兒的紅細胞上雖然結合了其母不完全抗體,但直抗試驗陰性,這并不表示其紅細胞上沒有結合抗體,可能只是抗體較少不足以和抗人球蛋白產生可見的反應,將其放散液做間接抗人球蛋白試驗(即釋放試驗）則可表現為陽性結果,此種情況即直抗試驗陰性同時游離試驗與釋放試驗陽性的比例最多為39例(占49.37%）。在根據3項試驗結果確診ABO-HDN的判斷方法中,僅一種陽性分布沒有出現,即釋放試驗陰性同時直抗與游離試驗陽性,考慮到診斷ABO-HDN的最有力證據是證實患兒紅細胞被來自母親的IgG抗A(B）所致敏[4],此種情況下患兒紅細胞已致敏了不完全抗體,且血清中亦存在游離的抗體,理論上釋放試驗應該是陽性,故可以確診,有研究認為[11]此種結果與制備放散液沒有控制好時間和溫度有關,導致釋放試驗假陰性。本研究結果顯示,79例疑似ABO-HDN樣本中,確診的70例樣本抗體釋放試驗均為陽性,以上都說明在ABO-HDN的溶血3項試驗中,以抗體釋放試驗最為重要、敏感度最高,是診斷ABO-HDN最有力的證據[12]。

報告顯示[4],在ABO-HDN的檢測中,溶血3項試驗陽性率與采血時機有很大關系,患兒的血清學檢查最好在出生后3-7天進行,以防止致敏的紅細胞大部分被破壞,從而使真正的ABO-HDN漏檢。可見,ABO-HDN的檢出率與新生兒出生時間有關,其篩查試驗就是要快速檢測出新生兒紅細胞上的IgG類抗體,為避免可能出現的“高膽紅素血癥”及其他危及新生兒的嚴重后遺癥,故臨床上對ABO-HDN患兒應做到盡量早發現早作檢測以確診。本研究結果表明,出生天數小于或等于5天新生兒ABO-HDN的陽性率為95.08%,明顯高于出生天數大于5天新生兒的66.67%,兩者差異具有統計學意義(P＜0.01）。因此,母嬰ABO血型不合并發生新生兒黃疸的疑似ABO-HDN患兒,應盡早送檢且最好采用出生5天內的標本,可提高陽性指標的檢出率,以明確診斷從而避免延誤治療。

在ABO-HDN血清學檢查中,除血型鑒定外,其他均是以抗人球蛋白試驗(Coombs試驗）為技術手段的IgG類抗體檢測。傳統的試管法Coombs試驗檢測IgG類抗體及直抗試驗步驟多、操作繁瑣費時,且受時間、凝集強度等因素的影響,結果判定有一定難度。當前,以微柱凝膠技術為代表的一批微試管柱凝集技術在國外已成為常規的紅細胞血型血清學檢測方法,國內有研究表明[13],采用國產微柱凝膠免疫檢測試劑卡進行ABO-HDN血清學系列試驗,結果可靠與臨床診斷符合率達98%,ABO-HDN陽性檢出率顯著高于同時平行采用的試管法,認為該國產微柱凝膠方法為新生兒溶血病實驗室診斷提供了可靠依據。結合本實驗研究結果,通過應用國產微柱凝膠試劑卡進行ABO-HDN 3項試驗的檢測,顯示該方法能快速準確檢測出ABO-HDN,且操作簡便,結果可保存,值得臨床推廣。

[1]李 勇,馬學嚴主編.實用血液免疫學血型理論和實驗技術[M].北京:科學出版社,2006.410-411.

[2]Kim W D,Lee Y H.A fatal case of severe hemolytic disease of newborn associated with anti-Jkb[J].J Korean Med Sci,2006,21(1）:151.

[3]胡亞美,江載芳,諸福堂.實用兒科學[M].第 7版.北京:人民衛生出版社,2003,477.

[4]葉應嫵,王毓三,申子瑜.全國臨床檢驗操作規程[M].第3版.北京:中華人民共和國衛生部醫政司,2006.267-268.

[5]劉達莊主編.免疫血液學[M].上海:上海科學技術文獻出版社,2002.135-136.

[6]Narang A,Jain N.Hemolytic disease of newborn[J].Indian J Pediatr,2001,68(2）:167.

[7]皇甫琴.新生兒 ABO溶血75例臨床分析[J].新生兒科雜志,2004,19(4）:170.

[8]馬曉紅,韓 林,毛瀟君.新生兒ABO溶血病10年病例回顧分析[J].中國優生與遺傳雜志,2001,9(6）:76.

[9]彭德仁.中國漢族人ABO血型的分布[J].中國輸血雜志,1991,4(1）:21.

[10]Cianciarullo M A,CecconM E,Vaz F A.Prevalence of immunohematologic tests at birth and the incidence of hemolytic disease in the newborn[J].Rev Assoc Med Bras,2003,49(1）:45.

[11]鄭艷玲,周小在.微柱凝膠法在新生兒溶血病檢測中的應用[J].檢驗醫學與臨床,2008,5(17）:1027.

[12]Brumit M C,Stubbs J R.Conventional tube agglutination with polyethylene glycol versus Red Cell Affinity Column Technolgy(ReACT）:a comparison of anltibody detection methods[J].Ann Clin Lab Sci,2002,32(2）:155.

[13]劉 冰,趙 震,林宏杰,等.微柱凝膠免疫檢測法在新生兒溶血病臨床診斷上的應用[J].中國實驗診斷學,2006,10(5）:544.