Src介導NEDD4-1在調控膠質瘤U251細胞侵襲性作用中的研究

張家留,張 豐*,殷麗萍,于如同

(1.江蘇省中西醫結合醫院,江蘇南京 210028;2.徐州醫學院附屬醫院）

膠質瘤是主要的顱內腫瘤之一,其預后不佳。探討膠質瘤發生過程中增殖、侵襲的的分子病因學機制,以尋找相應的治療靶點是臨床和科研工作中的迫切需求[1]。黏著斑激酶(FAK）的激活,是腫瘤發生侵襲的重要機制,FAK通過增強整合素和生長因子介導的Ras-MAPK的通路活性,促進腫瘤細胞的轉移。酪氨酸激酶Src是腫瘤早期出現的致癌性蛋白激酶,參與諸如細胞周期、增殖、細胞骨架形成、生長因子信號傳遞等諸多腫瘤生長相關機制[2,3]。Src與FAK關系密切,Src結合并激活FAK,而活化的FAK-Src復合物則通過底物磷酸化介導下游反應。抑癌基因PTEN能通過抑制黏著斑激酶(FAK）和酪氨酸激酶 Src的磷酸化,從而選擇性Ras-MAPK通路[4,5]。但PTEN的泛素連接酶NEDD4-1(neural precursor cell expressed developmentally downregulated 4-1）的過表達能夠下調PTEN的功能,從而促使腫瘤發生和轉移[6]。

對于Src蛋白在NEDD4-1介導的膠質瘤在侵襲性的作用,目前尚無臨床報道。本實驗擬采用RNA干擾技術(RNAi）,通過抑制Src在膠質瘤U251細胞系中的表達,探索其對下游信號分子蛋白的影響,進一步揭示Src在干擾膠質瘤細胞侵襲中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

本實驗依托徐州醫學院神經外科及神經生物學實驗室(該實驗室為SPF級重點實驗室）。實驗中的硬件及軟件材料大部分由該實驗室提供,其中實驗中所需的U251細胞購自中國典型培養物保藏中心(武漢大學保藏中心）。所需的pcDNA3.1-NEDD4-1質粒由美國Memorial Sloan-Kettering腫瘤中心細胞生物學實驗室提供。pGPU6/GFP/Neo-NEDD4-1質粒由本實驗室構建、保存。pcDNA3.1-Src siNRA質粒均根據所查相關堿基序列購于上海吉凱基因化學技術有限公司。實驗中所需的抗體:FAK(C-20）(Santa Cruz公司,Sc-558）;FAK(phosphoY397）(Genetex公司,Gtx24803）;山羊抗兔IgG抗體的二抗;小鼠抗人GAPDH單克隆抗體(上海吉凱化學技術公司）

1.2 方法

1.2.1 實驗設計 實驗分4組:(A）pcDNA3.1-空質粒轉染組(B）pcDNA3.1-NEDD4-1組:U251轉染pcDNA3.1-NEDD4-1,(C）pcDNA3.1-NEDD4-1+Src轉染細胞組:U251轉染NEDD4-1及Src,(D）Src siRNA組:U251轉染pcDNA3.1-Src siRNA。最后通過Transwell細胞侵襲實驗及劃痕法遷移實驗觀察膠質瘤U251細胞侵襲情況。

1.2.2 ShRNA表達質粒的構建通過查詢Src基因序列,利用Elbashir[7]等推薦的siRNA設計原則,尋找合適的siRNA靶序列。采用NCBIGenBank(美國國立醫學圖書館和美國國立衛生研究院編寫）提供的BLAST軟件對選擇的靶序列進行同源分析,排除siRNA非特異性地抑制其他基因片段的可能。采用Ambion公司的shRNA在線設計軟件(www.ambion.com）設計可克隆入 pGPU6/GFP/Neo表達載體的shRNA,Src siRN的有效作用靶點:5′-AAGCTGTTCGGAGGCTTCAAC-3′(226-244 bp）購于上海吉凱基因化學技術有限公司。

1.2.3 試驗中通過對該序列質粒DNA小量快速抽提后,并大量制備和純化。然后質粒的穩定轉染膠質瘤細胞。轉染24 h后移除轉染試劑,轉染72 h后換完全培養基(1640,加10%的FBS,青霉素、鏈霉素各100 μ g/ml）,分別于轉染后1,3,5,7 d收集細胞檢驗目的基因的活性。最后通過Transwell細胞侵襲實驗(參照Valster A,et al(2005）.Cell migration and invasion assays.Methods37(2）208-215報道方法進行操作。在24孔板中放入轉移培養皿(Transwell,培養皿直徑6.5 mm,微孔徑 8.0 μ m）,轉移培養下室加600 μ l含0.5%的胎牛血清(作為趨化因子）的DMEM。細胞用2 mmol/L EDTA消化、離心,收集并用無血清DMEM洗滌兩次,重懸于無血清DMEM中,調節濃度至 2×105細胞/ml,取100 μ l細胞懸液加入上室,0.5%結晶紫染色5 min,在200倍顯微鏡下計數膜下細胞以膜下細胞的數量多少表示遷移能力。每組細胞進行3次獨立實驗。）及劃痕法遷移實驗(參照Valster A,et al(2005）.Cell migration and invasion assays.Methods37(2）,208-215報道方法進行操作。取80%匯合的細胞,胰蛋白酶消化后以1.2×105個細胞/孔接種于包被有Fn的6孔培養板上,貼壁12 h后換無血清培液培養24 h,細胞基本匯合。用無菌1 ml槍頭垂直在培養板底劃平行、垂直的4對‖劃痕,無血清培液沖洗若干次,以洗去被劃下的細胞。于指定時間點在顯微鏡下從劃痕邊緣遷移出的細胞,每組設雙復孔,反復進行3次獨立實驗。）觀察膠質瘤U251細胞侵襲情況。

1.2.4 數據處理

用于分析統計的軟件有sigmastat3.0、spss14.0,實驗數據以均數±標準差(ˉx±s）表示。統計分析采用單因素方差分析(ANOVA）,多個實驗組與一個對照組比較采用最小顯著差法(LSD）,實驗組之間比較采用q檢驗(Newman-keuls test）(P＜0.05為差異有統計學意義）。

2 結果

2.1 Src shRNA表達質粒的鑒定

將重組Src shRNA表達質粒轉化感受態DH5α,提取的質粒用BamHⅠ和PstⅠ內切酶分別單酶切。PstⅠ酶切結果顯示有2條帶,一條為超螺旋的SC構型,一條為質粒的松弛開環的OC構型。重組體被BamHⅠ單酶切而線性化,條帶大小為232 bp。送目的質粒DNA由上海吉凱生物技術公司完成測序,T3 啟 動 子 引 物 5′-AAGCTGTTCGGAGGCTTCAAC-3′(226-244 bp）,結果顯示插入序列與設計的shRNA堿基序列完全一致,無突變(圖1）。

2.2 重組質粒對U251膠質瘤細胞的影響

U251細胞轉染48 h后,Src siRNA組與空對照組相比,RT-PCR測得Src表達明顯下降,Src+NEDD4-1組Src表達增強,而NEDD4-1組幾乎無太大的變化。實驗組Src shRNA組,Src+NEDD4-1組卻變化較大。并且Src shRNA水平的下調影響其本身以及NEED4-1的表達(圖1）。

2.3 Western blot分析U251細胞中Src蛋白的表達結果

Western blot方法檢測膠質瘤細胞U251中Src的表達情況發現其Src較正常膠質細胞表達增加。實驗結果顯示,Src蛋白激酶被RNA干擾后的U251膠質瘤細胞和未干擾的U251細胞相比,出現了明顯的G1/S期的阻滯及凋亡率的上升。同時,Src蛋白表達缺失。而Src+NEDD4-1組轉染質粒組Src蛋白表達在各組中最強。ND4組變化不大(圖2）。

圖1 Src shRNA ND4表達質粒的PCR及酶切鑒定

圖2 轉染后Western Blot結果分析

2.4 Src介導NEDD4-1引起的膠質瘤細胞遷移、侵襲性的變化

應用劃痕法測定轉染的四組在U251細胞中遷移能力的變化(圖3-5）。實驗結果顯示:轉染Src+ND4組16 h后向劃痕內遷移的細胞侵襲距離較其他各組呈明顯增強趨勢,而轉染 shRNA質粒的U251細胞16 h后向劃痕內遷移的細胞侵襲距離較其他各組明顯降低。這一發現提示Src shRNA抑制膠質瘤細胞遷移能力的作用中扮演關鍵的開關角色(如表1）。

表1 轉染各組膠質瘤細胞侵龔距離(±s）

表1 轉染各組膠質瘤細胞侵龔距離(±s）

干擾組與控制組比較,△P＜0.5,干擾組與Src+ND4組間比較,*P＜0.1

分組 侵襲距離(平均差±標準差）CONTROL 86.6±7.1 NEDD4-1 87.2±8.1 Src+NEDD4-1 90.80±10.2 ShR NA 34.9±7.2△*

圖3 Src介導下膠質瘤細胞遷移能力的變化

圖4 T ranswell細胞侵襲實驗分析細胞侵襲能力的變化

進一步用Transwell細胞侵襲實驗分析細胞侵襲能力的變化。實驗結果顯示,轉染Src與NEDD4-1質粒在U251細胞的細胞侵襲性較轉染空載體對照組明顯增強。可以看出NEDD4-1與Src質粒的轉染可以促進膠質瘤細胞的侵襲性,而在Src shRNA則通過抑制Src的作用進而抑制U251細胞的侵襲性。

圖5 Src介導下膠質瘤細胞遷移、侵襲性的變化

3 討論

我們在表達Src shRNA重組載體構建成功的基礎上,對其抑制膠質瘤細胞中Src基因表達的效果進行檢測,并觀察Src基因表達下降對膠質瘤細胞生物學特征的影響。

從Transwell細胞侵襲實驗結果分析細胞侵襲能力的變化看出:轉染的Src+NEDD4-1質粒細胞組U251細胞侵襲性較其他各組明顯增強,而Src shRNA通過抑制Src的活性進而抑制膠質瘤U251細胞的侵襲性。同時,應用劃痕法測定轉染的四組細胞中遷移變化得出的結果與Transwel實驗相符。可以看出Src+NEDD4-1質粒轉染可以促進膠質瘤細胞的侵襲性。

Western blot實驗表明膠質瘤U251細胞系中Src蛋白的正常表達(見圖2）。應用Src酪氨酸激酶抑制劑shRNA抑制U251細胞中Src酪氨酸激酶活化,能夠抑制Src的表達;相反,NEDD4-1+Src組與其他三組相比Src蛋白表達明顯增強[8]。

同時大量的文獻發現Src還作用于整合素依賴性粘附、細胞骨架肌動蛋白重排以及整合素基因表達調節及信號傳導機制中的二級分子[9]。各種體內外實驗也證實Src腫瘤增值有促進作用。對編碼無激酶活性形式的Src的DNA進行顯微注射,或是壓制識別Src末端保守序列的抗體,都能抑制由GEF,PGDF和CSF誘導的DNA合成。此外,無活性的激酶或是缺少結構域的Src突變體在Src的成纖維細胞中的表達,也能阻斷PGDF誘導的DNA合成。Src的SHZ域是與PDGF受體結合所必需的;SH3域突變的Src突變體干擾了由PDGF和GEF所誘導的NDA合成,證明SH3域在這些生長因子誘導的DNA合成中有重要作用[10]。

與人膠質瘤發生發展相關基因的研究進展較快,依據膠質瘤細胞分化障礙、膠質瘤惡性進展發生情況,已明確的基因包括KRa,Ink4a-Arfs,PDGF,RB,TP53等[11],尚未涉及到與Src的關系。本研究選擇Src作為靶基因,原因是它在神經節膠質細胞瘤惡變成多形性膠質母細胞瘤過程中,隨惡性程度增高而表達增加。從目前膠質瘤起源細胞的研究進展來看,這類腫瘤細胞來源于神經元和膠質細胞的共同前體細胞,即神經干/祖細胞的可能性很大[12]。而我們在人胎腦來源的神經干/祖細胞體外分化過程中又發現了它隨細胞分化程度增高而表達量下降。而Src在膠質瘤體外細胞系高表達,并隨惡性程度增高表達增高[13]。

Src蛋白激酶功能復雜,已經明確的是機體細胞有絲分裂過程中起G1-S期的關鍵作用[14-15],細胞無論是走進還是走出分裂周期都需要它的參與。在G1后期Src與cyclinB1結合形成有絲分裂促進因子(MPF）,它的高表達是腫瘤細胞無限增殖的源動力,已在多種腫瘤中檢測到它的高表達[16-17]。Src高表達還可以通過紡錘體檢查點的改變,促進癌細胞染色體的不穩定性[18],因此它又是腫瘤異質性和惡性進展的根源。我們在人腦膠質瘤U251培養的細胞轉染穩定表達Src shRNA的重組的實驗結果表明,腫瘤細胞Src被表達干擾后,其侵襲能力顯著下降,增殖周期阻滯在G1/S期,凋亡比例增加。由此以反證法證明了Src在膠質瘤發生發展過程中起重要作用和作為病因分子的潛在靶基因治療的價值。

綜上所述,本研究對Src在膠質瘤中的表達、分布以及Src在NEDD4-1發揮作用過程中的角色及其下游信號分子進行了初步研究揭示了:NEDD4-1通過Src在細胞的凋亡、腫瘤的發生及其侵襲性過程中發揮著重要作用。做為Src的抑制劑Src shRNA在人腦膠質瘤中的表達及對腫瘤細胞生長、侵襲作用可能成為膠質瘤治療的又一靶點。而更為重要的是對NEDD4-1基于Src引發的一系列信號轉導通路的研究則可能進一步發現膠質瘤發生、發展、侵襲的生物學信息,為最終揭示其生長、侵襲的機制提供依據。

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