卵巢惡性腫瘤標志物-CA125微柱凝膠免疫檢測方法的建立及評價

方紅娟,蔡智天,鐘 磊,潘 穎,宋 波,杜 博

(1.吉林大學第四醫院 電診科,吉林 長春 130011;2.吉林大學第一醫院生殖中心,吉林 長春130021;

3.吉林大學中日聯誼醫院骨科,吉林 長春130033;

4.吉林大學中日聯誼醫院 婦產科,吉林 長春130033;5.吉林省腫瘤醫院 核醫學科,吉林 長春 130012）

卵巢惡性腫瘤(Ovarian malignant tumor）是危害婦女生命和健康的主要疾病,而在卵巢惡性腫瘤的病理類型中,卵巢上皮性惡性腫瘤最多,死亡率亦最高,如果對卵巢惡性腫瘤能夠做出早期診斷,可使患者的長期生存率得到顯著提高。有研究表明,卵巢上皮性惡性腫瘤的血清特異性標志物為CA125[1]。

微柱凝膠技術,是近年來在國外很多先進血液免疫實驗室得到大力推廣的一種新的檢測技術,作為一種新型定性的檢測方法,它具有較高的檢測靈敏度[2,3],已在臨床應用于多項疾病的早期篩查和診斷[4]。

目前臨床多采用化學發光免疫分析法檢測患者血清CA125的表達作為早期篩查卵巢惡性腫瘤的方法,與該方法相比,微柱凝膠技術具有操作簡單、省時、敏感性高、結果易保存等優點[5,6],有很大開發利用價值。微柱凝膠技術用于卵巢惡性腫瘤標志物CA125的檢測,目前國內外均未見報道。本研究應用微柱凝膠的檢測原理,根據患者病理診斷選取265例正常婦女及232例卵巢上皮性惡性腫瘤患者作為研究對象,檢測血清中CA125的表達情況,并與化學發光免疫分析法檢測結果進行對比,探討微柱凝膠法檢測卵巢惡性腫瘤標志物CA125對卵巢惡性腫瘤的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象收集吉林大學中日聯誼醫院、長春市婦產科醫院和吉林省腫瘤醫院2007年4月至2009年1月間婦科住院患者血清標本,均有完整的臨床資料。患者年齡在15-77歲之間,平均年齡46歲。

1.2 標本收集及處理抽取靜脈血約3 ml,離心機12 000 r/min分離血清,取上清液置-20℃保存。

1.3 入選病例的觀察及分組卵巢上皮性癌(Ⅰ-Ⅱ期）及卵巢上皮性癌(Ⅲ-Ⅳ期）232例,所有卵巢惡性腫瘤患者均未合并其他惡性腫瘤,正常婦女血清265例。分別應用微柱凝膠法及目前臨床應用的化學發光免疫分析法檢測血清中CA125的量。所有研究對象均有病理診斷。

1.4 主要試劑及實驗方法兔抗CA125IgG(生物素標記）、羊抗兔IgG、親和素購自北京博奧森生物技術有限公司;微柱凝膠免疫分析技術專用離心機和孵育器由長春博研醫學生物儀器公司生產;MGCoombs'試劑卡由長春博訊生物技術有限公司提供。儀器:離心機(德國生產）,振蕩器(水浴恒溫）(江蘇金壇市金成國勝試驗儀器廠）。化學發光免疫分析試劑由CH IRON公司提供,液相試劑為標記吖啶酯的M 11單克隆抗體。固相試劑為包被在磁粉顆粒上的OC125單克隆抗體。儀器為美國CH IRON公司生產的ACS:180全自動化學發光免疫分析儀。實驗方法:包括指示細胞的制備,微柱凝膠的制備。將兔抗CA125抗體稀釋倍數為1∶200,指示紅細胞稀釋100倍,50 μ l待檢血清加入微柱凝膠卡中,將50 μ l稀釋的兔抗CA125抗體加入微柱凝膠卡中,置37℃恒溫孵育器中30 min,將稀釋好的指示紅細胞50 μ l加入卡里,孵育 15 min,后置離心機離心 15 min?；瘜W發光免疫分析法采用雙抗體夾心法,分析過程采用自動化,儀器自動吸樣品50 μ l,液相試劑250 μ l,固相試劑 250 μ l,37 ℃溫浴 7.5 min,沖洗后,自動加入反應試劑(堿性雙氧水）,激發反應,其發光強度與樣品濃度呈正比。

1.5 結果判定標準觀察的陽性結果以肉眼見紅細胞被扣留在凝膠之間為陽性,紅細胞沉淀在管底為陰性[7],+為1/4紅細胞少部分被扣留在凝膠之間,2+為1/2紅細胞被扣留在凝膠之間,3+為3/4紅細胞被扣留在凝膠之間,4+為肉眼見紅細胞全部被扣留在凝膠之間;化學發光免疫分析法按藥盒上的建議＞35 U/mL為陽性值。

2 結果

本實驗以病理診斷作為金標準,微柱凝膠法和化學發光免疫分析法檢測卵巢上皮性惡性腫瘤血清CA125的結果,計算兩種檢測方法的靈敏度和特異度分別為 84.6%,88.6%和88.4%、91.3%。(見表1和表2）

表1 微柱凝膠免疫檢測法檢測血清CA1254的結果

表2 化學發光免疫分析法檢測血清CA125結果

3 討論

卵巢腫瘤標志物對于腫瘤的早期發現、監測,甚至靶向性治療具有重要意義。卵巢癌腫瘤標志物研究較多的是血清CA125,血清CA125水平的確與卵巢癌的惡性程度有關,在絕經后婦女中證實有篩查卵巢癌的價值。血清卵巢癌的腫瘤標志物的檢測方法有多種,如ELISA方法[8],化學發光免疫分析法測定,放射免疫技術,質譜技術,基因和蛋白質組學[9,10]等,目前臨床上常用的腫瘤標志物檢測方法為化學發光免疫分析法,是目前各種免疫分析中最有前途的方法之一,但此項檢測儀器價格昂貴,不適于在社區或經濟效益小的中小醫院開展,亦不適于作為早期卵巢癌篩查的首選。Y.Lapierre[11]介紹了一項免疫學檢測新技術即微柱凝膠免疫實驗。該技術的本質是血凝試驗,即紅細胞抗原抗體在微柱腔內的凝膠介質中發生肉眼可見的免疫凝集反應。它的特點為:簡單、可標準化、自動化、重復性好,一卡六管,減少標記,避免錯誤,所需標本量少、無須洗滌、結果穩定、易于判讀。目前傾向于多種血清腫瘤標志物聯合檢測[12],以提高診斷的敏感度和特異度。但因本實驗經費有限,本文只進行了卵巢惡性腫瘤標志物CA125的檢測,未進行多種腫瘤標志物的檢測,此部分將在后續的實驗中進一步證實。利用其優點,本研究應用微柱凝膠的原理,檢測卵巢惡性腫瘤標志物CA125的水平并與化學發光免疫分析法進行比較。

本研究顯示,微柱凝膠檢測方法檢測靈敏度、特異度更接近化學發光分析方法的檢測靈敏度及特異度。

我們可以利用微柱凝膠檢測方法簡便、快捷、以及成本低的特點,可在一些經濟及技術比較落后的縣級及鄉鎮衛生醫院替代目前臨床常用的化學發光免疫分析法,作為卵巢惡性腫瘤早篩查、早診斷及治療后的跟蹤隨訪一線檢測方法。為其在臨床上腫瘤標志物的檢測提供了更廣闊的發展空間。

[1]郁琦綜述.連利娟審校.CA125與卵巢上皮癌[J].國外醫學?婦產科學分冊,1991,18(1）:12.

[2]Novaretti MC,Jens E,Pagliarini T,et al.Comparison of conve-ntional tube test with diamed gel microcolumn assay for anti-D titration[J].Clin Lab Haematol,2003,25:311.

[3]Kimura S,Yurugi K,Segawa H,et al.Rapid quantitation of immunog-lobulin G antibodiesspecific for blood group antigens A and B by surface plasmon resonance[J].Transfusion,2005,45:56.

[4]李 勇,馬學嚴.實用免疫血液學[M].第2版,西安:陜西科學出版社,2006.562-570.

[5]周金安,魏 晴,涂同濤,等.微柱凝膠卡及試管法對抗D效價檢測的比較[J].中國輸血雜志,2008,21(3）:197.

[6]渾守永,劉明霞,王玉芝.微柱凝膠技術在不規則抗體篩選中的應用[J].現代檢驗醫學雜志,2006,21(1）:38.

[7]王小平.微柱凝膠法應用于血型鑒定[J].廣州醫藥,2007,38(2）:61.

[8]Shafat I,Zcharia E,Nisman B,NadirY,Nakhoul F,Vlodavsky I,et al.An ELISA method for the detection and quantification of human heparanase[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,341:958.

[9]Hibbs K,Skubitz KM,Pambuccian SE,et al.Differential gene expression in ovarian carcinoma:identifi cation of potential biomarkers[J].Am J Pathol,2004,165:397.

[10]Israeli O,Gotlieb WH,Friedman E,et al.Genomic analyses ofprimary andmetastatic serous epithelial ovarian cancer[J].Cancer Genet Cytogenet,2004,154:16.

[11]Lapierre Y,Rigal D,Adam J.The gel test:A new way to detect red cell antigen antibody reactions,1990.

[12]Murray-Zmijewski F,Lane DP,Bourdon JC.p53/p63/p73 isoforms:an orchestra of isoforms to harmonise cell differentiation and response to stress[J].Cell Death Differ,2006,13:962.