草豆蔻總黃酮抗氧化活性研究

吳珍，陳永順，王啟斌

(湖北醫藥學院附屬太和醫院1.消化內科;2.藥學部，湖北十堰442000)

草豆蔻主要化學成分為黃酮類和揮發油。草豆蔻總黃酮具有健胃、止吐、抑制血小板聚集和腫瘤形成、抗炎抑菌等藥理作用[1-3]。筆者在本實驗中研究草豆蔻總黃酮的體內外抗氧化活性，并與茶多酚的抗氧化性能比較，以期為深入開發應用該藥提供實驗依據。

1 材料

1.1 試藥與儀器草豆蔻藥材(購自湖北省十堰市宏康藥材公司，批號:20100215，經我院中藥房鑒定為姜科山姜屬植物草豆蔻種子)，二苯代苦味酰肼自由基(2，2 diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH，Sigma公司)，茶多酚(湖北武漢浩河化工廠，純度≥98.8%，批號:20090621)，番紅花紅(溫州市甌海精細化工公司，批號:20090317)，維生素E(浙江新和成股份公司，批號:20100106)，D-半乳糖(上海試劑廠，批號:F20090108)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒(上海超研生物科技有限公司，批號:20090230)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒(上海超研生物科技有限公司，批號:20090407)。其余試劑均為國產分析純。

1.2 動物SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，體質量(20±2.0)g，湖北醫藥學院實驗動物中心提供，動物合格證號:SCYY(鄂)2004-0012。

2 方法與結果

2.1 草豆蔻總黃酮的提取[4]精密稱取草豆蔻粉末200 g，過內徑0.600 mm(30目)篩，用8倍量95%乙醇回流提取兩次，每次2 h，提取液減壓濃縮至含醇量約10%，抽濾，除去雜質，加60%乙醇定容至100 mL，作為供試品溶液，備用。經測定，總黃酮含量為6.82%。

2.2 統計學方法數據使用SPSS11.5軟件進行統計分析，結果以均數±標準差±s)表示，組間比較采用t檢驗。

2.3 體外抗氧化實驗

2.3.1 DPPH法DPPH是一種較為穩定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm波長處有吸收峰。測試時分別以50%乙醇將茶多酚、草豆蔻總黃酮提取液配制成相應濃度。按文獻[5]方法測定，分別在517 nm波長處測定不同濃度樣品2 mL加DPPH 2 mL的吸光度(Ai)，不同濃度草豆蔻總黃酮樣品2 mL加50%乙醇2 mL的吸光度(Aj)，50%乙醇2 mL加DPPH2 mL的吸收光度(A0)。實驗平行3次，草豆蔻總黃酮樣品及對照品分別測8個濃度，以50%乙醇作為空白。草豆蔻總黃酮樣品對DPPH自由基的清除能力(SA)可采用以下公式計算:SA(%)=[1－(Ai－Aj)]/A0×100%。結果見圖1。

草豆蔻總黃酮與茶多酚對DPPH自由基都表現出明顯的清除活性，清除作用隨濃度的增加而增強，茶多酚對DPPH自由基的清除能力強于草豆蔻總黃酮，當濃度達到10 mg·mL-1時，兩者對DPPH自由基的清除能力相近，最大清除率可達78%。

2.3.2 草豆蔻總黃酮清除羥自由基活性測定[6]采用Fe(Ⅱ)催化過氧化氫(H2O2)產生羥自由基(Fenton反應)，該反應產生的羥自由基可使番紅花紅褪色。針對這一特點來研究草豆蔻總黃酮對羥自由基的清除能力。取0.15 mol·L-1pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液1.0 mL，40 μg·L-1番紅花紅1.0 mL，0.945 mmol·L-1乙二胺四乙酸(EDTA)-Fe(Ⅱ)(新鮮配制)1.0 mL，不同濃度的樣品溶液0.5 mL、3%H2O21.0 mL(新鮮配制)，混合后在37℃水浴中反應30 min后在520 nm波長處測定吸光度(As)?？瞻捉M以純化水0.5 mL代替樣品測定吸光度(A0)，對照組以純化水1.5 mL代替H2O2和樣品測定吸光度(A)，用純化水3.5 mL代替番紅花紅、EDTA-Fe(Ⅱ)、H2O2、樣品，磷酸鹽緩沖溶液1.0 mL，調零。并按下式計算清除率:清除率(%)=(As－A0)/(A－A0)×100%，結果見圖2。

當草豆蔻總黃酮的濃度≥0.8 mg·mL-1時，清除率達到最大，最大清除率為88.5%，而此時茶多酚的清除率為58.5%，表明同濃度時，草豆蔻總黃酮對羥自由基的清除活性強于茶多酚。

2.3.3 抑制脂質過氧化活性測定取大豆卵磷脂溶液0.5 mL(大豆卵磷脂200 mg溶解于10 mmol·L-1pH7.4磷酸鹽30 mL，冰浴震蕩)，加入pH7.14磷酸鹽緩沖液1.0 mL，不同濃度的樣品溶液1 mL，2.5 mmol·L-1EDTA-Fe(Ⅱ)1.0 mL，混勻后于37℃水浴中反應45 min，再加入28%三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)2.0 mL，1%硫代巴比妥鈉(thiobar bituric acid，TBA)1.0 mL，混勻后置于100℃沸水浴中加熱10 min，冷卻后在532 nm波長處測定吸光度(A樣)，用磷酸鹽緩沖液調零，空白管用磷酸鹽緩沖液代替樣品測吸光度(A0)。并按下式計算抑制率:抑制率(%)=(A0－A樣)/A0×100%。從圖3中可以看出，草豆蔻總黃酮與茶多酚對卵磷脂過氧化物的抑制作用相近，濃度≥1.0 mg·mL-1時，草豆蔻總黃酮的最大抑制率91.5%。

2.3.4 清除超氧陰離子自由基活性測定[7]取0.05 mol·L-1三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH=8.2)4.5 mL，置于25℃水浴中預熱20 min，分別加入試樣1 mL和25 mmol·L-1鄰苯三酚溶液0.4 mL，混勻后于25℃水浴中反應5 min，加入8 mmol·L-1鹽酸(HCl)1 mL終止反應，于299 nm處測定吸光度(Ai)，每個試樣做3個平行樣，行統計學處理?？瞻讓φ战M以相同體積純化水代替樣品。清除率(%)=(A0－A樣)/A0×100%。結果見圖4，隨著濃度的增加，草豆蔻總黃酮與茶多酚對超氧陰離子自由基的清除能力也增強，當兩者濃度≥1.0 mg·mL-1時，草豆蔻總黃酮的清除率為79.8%，茶多酚的清除率為80.8%，表明兩者對超氧陰離子自由基的清除能力相近。

2.4 體內抗氧化實驗

2.4.1 造模與給藥將小鼠隨機分成6組，每組6只，分別為正常對照組，衰老模型組，維生素E組，草豆蔻總黃酮低、中、高劑量組。除正常對照組外，其余5組小鼠均按100 mg·kg-1·d-1皮下注射D-半乳糖造模，正常對照組皮下注射等體積0.9%氯化鈉溶液。造模同時給藥治療，維生素E組按0.05 g·kg-1·d-1灌胃給藥，草豆蔻總黃酮低、中、高劑量組分別按相當于生藥材20，40，60 g·kg-1·d-1灌胃給藥，正常對照組和衰老模型組給予等體積純化水，連續42 d。

2.4.2 樣品的處理小鼠摘眼球取血，抗凝劑抗凝后2 500 r·min-1離心10 min(離心半徑175 mm)，取上清液冰箱冷藏備用;動物處死后迅速取出肝組織塊，用冰0.9%氯化鈉溶液洗滌除去血液，濾紙拭干，分別稱取0.2～0.3 g加入0.9%氯化鈉溶液(0.9%氯化鈉溶液體積總量是組織塊質量的9倍)，制成10%肝組織勻漿，3 000 r·min-1離心10 min(離心半徑175 mm)，取上清液，置冰箱內冷藏備用。用時稀釋。

2.4.3 主要檢測指標血漿SOD活力及肝勻漿中MDA含量均依據試劑盒所附方法、步驟進行測定，并計算結果。草豆蔻總黃酮中、高劑量組血漿SOD活性明顯升高(P＜0.01)，肝臟MDA含量顯著降低(P＜0.01)，結果見表1。提示草豆蔻總黃酮在體內具有較好的抗氧化活性。

3 討論

筆者在本實驗中以常用的且具有較強抗氧化能力的茶多酚為對照，考察了草豆蔻總黃酮對羥自由基、脂質過氧化物及超氧陰離子自由基的清除能力，結果提示草豆蔻總黃酮具有較強的抗氧化能力，且抗氧化作用隨濃度的增加逐漸增強。本實驗以SOD及MDA這兩個指標來評價草豆蔻總黃酮體內的抗氧化活性，結果表明其可顯著提高血漿SOD活性，同時降低肝臟中MDA含量，提示其體內具有較好的抗氧化活性。

表1 6組小鼠血清SOD活性及肝臟MDA含量測定結果Tab.1Effects of the total flavonoids from Alpinia katsumadai Hayata and tea polyphenols on the serum levels of SOD activity and MDA content in liver homogenate of aging mice in 6 groups±s

表1 6組小鼠血清SOD活性及肝臟MDA含量測定結果Tab.1Effects of the total flavonoids from Alpinia katsumadai Hayata and tea polyphenols on the serum levels of SOD activity and MDA content in liver homogenate of aging mice in 6 groups±s

與衰老模型組比較，*1P＜0.01，*2P＜0.05Compared with aging model group，*1P＜0.01，*2P＜0.05

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黃酮類化合物主要通過酚羥基與自由基進行抽氫反應生成穩定的半醌自由基，從而中斷鏈式反應，達到抗氧化作用，且高效低毒[8]。本研究提示草豆蔻總黃酮具有較強的抗氧化活性，但其活性成分有待進一步研究。

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