酶解－微波法提取黃芪多糖的工藝研究

董玲玲，黃 鑫，齊陽光，馮 海

（浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310032）

酶解－微波法提取黃芪多糖的工藝研究

董玲玲，黃 鑫，齊陽光，馮 海

（浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310032）

研究纖維素酶酶解－微波法提取黃芪多糖的新工藝.采用單因素分析與正交實驗法，以黃芪多糖的提取率和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為評價指標(biāo)，考察酶料比、酶解時間、液固比、微波功率等工藝條件對多糖提取效果的影響.最佳工藝條件：酶料比57.6 U／g，酶解時間60 min，液固比10：1，微波功率480 W，提取時間8 min，重復(fù)提取1次，多糖提取率達(dá)到16.07%，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為88.40%，優(yōu)于文獻報道方法的提取效果.酶解－微波法具有耗時短、節(jié)約能源、提取率高、產(chǎn)物純度較好等優(yōu)點，是提取黃芪多糖的較理想方法.

黃芪多糖；酶解－微波法；正交設(shè)計

黃芪（RadixAstragali）又名膜莢黃芪、蒙古黃芪，為多年生草本豆科植物，其主要藥用成分為黃芪多糖、黃芪總黃酮和黃芪總皂苷等.其中黃芪多糖（Astragaluspolysaccharides，APS）是黃芪主要生物活性成分，可作為免疫增強劑或調(diào)節(jié)劑，促進抗體形成，同時還有抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗應(yīng)激、抗氧化和降脂等作用［1］.傳統(tǒng)的黃芪多糖提取方法有水煎煮法［2］及水回流提法［3］，提取率較低約在3.8%～9.78%之間.黃芪原料中纖維素的含量較高，是影響黃芪多糖溶出的主要因素之一，降低黃芪中的纖維素含量可以增加黃芪多糖的溶出.采用纖維素酶提取法［4］、堿醇提法［3，5］的提取率可達(dá)5.70%～19.15%之間，但是以上各種提取方法耗時長、能耗高、藥材利用度較低.微波提取法利用微波穿透力強的特點，具有提取時間短、選擇性好、加熱效率高、可保護有效成分不被破壞等特點［6－7］，可提高植物多糖提取率，我們擬結(jié)合纖維素酶解和微波提取的優(yōu)點，利用酶降解、破壞黃芪細(xì)胞壁，并采用微波促使多糖成分溶出，提高多糖的提取率，探索改善多糖純度的方法并與文獻報道方法進行比較.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

黃芪（購于杭州市九州大藥房，產(chǎn)地甘肅，符合中華人民共和國藥典2005版規(guī)定），纖維素酶（4 500 U／g，寧夏夏盛酶工程有限公司）.

葡萄糖（AR，廣東光華化學(xué)有限公司），無水乙醇（AR，安徽安特生物化學(xué)有限公司），98%硫酸（AR，衢州巨化試劑有限公司），苯酚（AR，杭州雙林化工試劑廠），所用水均為蒸餾水.

1.1.2 實驗儀器

FZ102植物粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司），752單光束紫外可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司），微波實驗裝置（最大功率800 W，2 450 MHz），RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），DHG-9240型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）.

1.2 實驗方法

1.2.1 黃芪多糖含量的測定

黃芪多糖的測定方法主要有苯酚－硫酸比色法和蒽酮－硫酸比色法.本實驗采用苯酚－硫酸法測定APS，其原理為多糖在濃硫酸的作用下水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚縮合生成橙黃色化合物，用比色法測定其含量［8］.

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖10 mg于100 mL容量瓶中加蒸餾水定容，搖勻，得100μg／mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液.精確移取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1，0.2，0.4，0.5，0.6 mL，分置于10 mL容量瓶中，各補加蒸餾水至2 mL，再分別加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5 mL，充分振搖2 min，靜置30 min后，補充濃硫酸至刻度，以蒸餾水為空白對照，于波長490 nm處測定吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程.

樣品含量測定：將提取液定容至250 mL.取1 mL按上述方法操作，測定吸光度，依回歸方程得黃芪多糖濃度.

1.2.2 黃芪多糖酶解－微波法提取工藝

黃芪烘干粉碎至20目→稱取10 g黃芪粉，加入蒸餾水（調(diào)節(jié)pH值）→加纖維素酶于恒溫干燥箱中酶解→微波浸提→過濾→取濾液濃縮→加5倍量95%乙醇沉淀→靜置過夜→取沉淀→烘干得粗多糖.

1.2.3 黃芪多糖提取工藝影響因素的考察

據(jù)文獻報道［4，9］，影響黃芪多糖提取工藝的因素主要包括物料粒度、液固比、酶料比、酶解溫度、pH、微波提取時間及次數(shù)等.首先采用單因素考察法對酶解反應(yīng)的溫度、pH、微波提取時間及次數(shù)等影響因素進行確定，并在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用正交設(shè)計優(yōu)化的方法對結(jié)果影響較大的酶料比、酶處理時間、液固比、微波功率等4個因素進行考察.實驗采用L9（34）正交實驗表，其因素水平見表1.以多糖提取率與所得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為考察指標(biāo)，其表達(dá)式分別為

表1 酶解－微波提取APS因素水平表Table 1 Orthogonal experimental design for the extraction of Astragalus Polysaccharides by the enzymatic-microwave method

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

測得的葡萄糖質(zhì)量濃度在1.0～6.0μg／mL范圍內(nèi)與吸光值呈良好線性關(guān)系，結(jié)果見圖1.其回歸方程為y＝0.112 9x＋0.014 9（R2＝0.998 1）.

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard cure for Glucose concentration determination

2.2 酶解的pH和溫度條件對APS提取率的影響

pH和溫度對酶的活性有重要影響，根據(jù)文獻報道［3，10］，在pH 值為4.8，6.0，7.0的介質(zhì)環(huán)境下分別在50℃和60℃條件下處理黃芪，測定多糖提取率.結(jié)果顯示當(dāng)pH＝6.0，溫度60℃時，酶活較好.

圖2 酶解pH和溫度條件對黃芪多糖提取率的影響Fig.2 Effects of pH and temperature on the extraction rate of APS

2.3 微波提取時間對APS提取率的影響

微波提取時間的長短直接影響有效成分的溶出.在酶料比57.6 U／g、酶解30 min、微波功率480 W、液固比10∶1的條件下，考察不同微波提取時間對黃芪多糖提取率的影響.

由圖3可知，微波提取時間為8 min時，多糖提取率達(dá)峰值，其后提取率降低.表明在微波提取8 min時，黃芪多糖已被基本提取完全，過長的提取時間反而會導(dǎo)致多糖的分解破壞.

圖3 微波提取時間對黃芪多糖提取率的影響Fig.3 Effect of microwave radiation time on extraction rate of APS

2.4 微波提取次數(shù)對APS提取率的影響

實驗考察了微波提取次數(shù)對APS提取效率的影響，結(jié)果見表2.由結(jié)果可知采用酶解－微波法提取2次，多糖已被基本提取完全，因此微波提取次數(shù)以2次為宜.

表2 微波提取次數(shù)對多糖提取率的影響Table 2 Effect of extraction times on the microwave extraction rate of APS

2.5 正交實驗結(jié)果

由單因素實驗可以確定酶解－微波提法酶解的條件為pH＝6.0，溫度60℃，微波提取2次，每次8 min.由于酶料比、酶解時間、液固比、微波功率對酶解－微波法提取APS的效果影響較大，因此對這四個因素進行正交實驗以獲得最佳的工藝條件.其正交實驗結(jié)果見表3.

表3 酶解－微波提取APS優(yōu)化實驗結(jié)果1）Table 3 Results of orthogonal experimental design for optimizing enzymatic-microwave extraction of APS

以提取率為評價指標(biāo)時，各因素對提取效果的影響程度依次為C＞A＞B＞D，最佳工藝參數(shù)為酶料比57.6 U／g，酶解時間120 min，液固比15∶1，微波功率480 W；以提取物中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（純度）為指標(biāo)時，各因素對提取效果的影響程度依次為C＞B＞A＞D，最佳參數(shù)為酶料比57.6 U／g，酶解時間60 min，液固比10∶1，微波功率480 W.方差分析結(jié)果表明這些因素間差異不顯著（P＞0.05）.以提取率為評價指標(biāo)時的因素B和C中k2，k3差異較小.綜合上述兩項考察指標(biāo)，選擇最佳參數(shù)組合為酶料比57.6 U／g，酶解時間60 min，液固比10∶1，微波功率480 W.

2.6 驗證實驗

按照正交設(shè)計所得最佳工藝條件，即酶料比57.6 U／g，酶解時間60 min，液固比10∶1，微波功率480 W，進行驗證實驗.結(jié)果多糖提取率高達(dá)16.07%，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)88.4%，兩種指標(biāo)均優(yōu)于其他參數(shù)組合，證明提取工藝已得到很好的優(yōu)化.由表4結(jié)果可知，酶解－微波法遠(yuǎn)優(yōu)于其他方法，APS提取率分別是直接酶提法、微波提法、水回流提法的151%，117%，332%，APS的純度分別為其他方法的138%，134%，235%.

表4 不同方法提取黃芪多糖效果的比較Table 4 Comparison of different extracting methods for APS extraction %

3 結(jié) 論

多糖屬于極性大分子化合物，不同的提取條件和方法對多糖的提取率和純度影響較大，傳統(tǒng)的提取方法提取率較低，其原因在于黃芪多糖作為大分子化合物較難通過細(xì)胞壁，不易被提取.纖維素酶可特異性地降解植物細(xì)胞壁所含纖維素，引起細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生局部疏松、膨脹、崩潰等變化，減少傳質(zhì)屏障對有效成分從胞內(nèi)擴散的傳質(zhì)阻力，促進黃芪多糖的溶出，并通過微波的能量加速細(xì)胞質(zhì)內(nèi)多糖向外擴散的速度［11］.將酶解與微波提取二者結(jié)合可大大提高APS的提取效率，優(yōu)化后的提取條件為酶料比57.6 U／g、酶解條件pH 6.0，60℃，酶解時間60 min、液固比10∶1、微波功率480 W，提取2次，每次8 min，提取率可達(dá)16.07%，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)88.40%，大大優(yōu)于相關(guān)文獻報道.酶解－微波提取法作為一種較新的提取工藝具有耗時短、能耗低、對產(chǎn)物破壞性小、提取效率高等優(yōu)點，可應(yīng)用于其他動植物藥有效成分的提取，值得進一步研究.

［1］熊成，王素敏，張然.植物多糖的一般研究［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2008，2（18）：115-116.

［2］倪艷，蘇強.黃芪多糖水煎提取工藝的優(yōu)化試驗研究［J］.中國中藥雜志，1998，23（5）：284-286.

［3］李萬玉，李安榮，徐曉玉，等.黃芪多糖的提取方法［J］.中國藥業(yè)，2009，18（11）：87-88.

［4］閆巧娟，韓魯佳，江正強.纖維素酶法提取黃芪多糖［J］.中草藥，2005，36（12）：1804-1807.［5］田洛，宣依昉，范榮軍，等.醇堿提取法提取黃芪多糖［J］.吉林大學(xué)學(xué)報：理學(xué)版，2006，44（4）：652-657.

［6］BAYRAMOGLU B，SAHIN S，SUMNU G.Solvent-free microwave extraction of essential oil from oregano［J］.Journal of Food Engineering，2008，88（4）：535-540.

［7］LIAO Zheng－gen，WANG Guang-fa，LIANG Xin-li.Optimization of microwave-assisted extraction of active components from Yuanhu Zhitong prescription［J］.Separation and Purification Technology，2008，63（2）：424-433.

［8］周文蘭，童列波.苯酚－硫酸法測定康克膠囊中多糖含量［J］.時珍國醫(yī)國藥，2001，12（7）：505-506.

［9］許海燕，楊義芳，黃春躍.微波提取黃芪中多糖的工藝研究［J］.中草藥，2008，39（10）：1496-1499.

［10］黃燕華，王國霞，周曄.不同纖維素酶的酶學(xué)性質(zhì)比較研究［J］.飼料研究，2006（11）：47-49.

［11］余洪波，張曉昱.酶法在中藥提取中的研究進展［J］.中成藥，2005，27（5）：591-593.

Study on the enzymatic-microwave extraction of Astragalus polysaccharides

DONG Ling-ling，HUANG Xin，QI Yang－guang，F(xiàn)ENG Hai
（College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

The microwave-assisted hydrolysis of cellulose was developed for the extraction ofAstragalusPolysaccharides（APS）.One-factor analysis and orthogonal experimental design were both applied to evaluate the extraction by the extraction rate and the purity of APS.The optimum enzymatic-microwave extraction condition was as follows：the liquid-to-solid ratio was 10∶1；the enzyme ratio was 57.6 U／g；the cellulase reaction time was 60 min before 8 min of microwave irradiation （480 W）.The extraction was repeated once.In these conditions，the maximum extraction rate could reach 16.07%and the purity could be up to 88.40%，which were much higher than those obtained from other extraction methods.The enzymatic-microwave assisted extraction is faster and more efficient with higher quality and therefore could be an ideal method for extracting the APS fromRadixAstragali.

Astragaluspolysaccharides；orthogonal experimental design；enzymatic-microwave extraction

R284.2

A

1006-4303（2011）05-0528-04

2010-04-06

浙江省重大科技專項基金資助項目（2007C12070）；浙江省科技計劃項目（2008C23058）

董玲玲（1983—），女，浙江寧波人，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物提取研究，E-mail：lan.453＠163.com.通信作者：馮海副教授，E-mail：fenghai289289＠163.com.

（

劉 巖）