川烏炮制品減毒增效的實驗研究

吳剛剛 ,章小菁,梁澤華

(浙江中醫藥大學,浙江 杭州 100053)

1 引言

川烏為毛茛科植物,烏頭的干燥母根,其性味辛 、苦 、熱 、有大毒,歸心 、肝 、腎 、脾經 。 臨床用其炮制品,功能為祛風除濕,溫經止痛主要治療風濕性關節炎,大骨節痛,半身不遂,偏頭痛,坐骨神經痛,虛寒性疝氣和跌打腫痛等[1]。但在治療過程中往往因服藥過量,導致中毒,臨床也常見中毒甚至死亡的事件。川烏主含多種生物堿,其中脂型生物堿毒性最大,主要毒性表現為胸悶,心悸,血壓下降(甚至測不出)和各種心律失常,并可導致休克,甚至死亡。本課題組為分析探索出川烏炮制的科學方法,特以毒性中藥川烏為基礎,通過正確的高效液相和細胞毒性的實驗分析方法,驗證川烏及其炮制品的毒性,可以為臨床診斷烏頭堿中毒,搶救烏頭堿中毒提供依據,也為毒理學研究川烏毒性提供參考[2]。

2 材料和方法

2.1 實驗動物

KM小鼠(18～22)g,雌雄各半,浙江中醫藥大學動物實驗中心提供(衛生使用許可證:SYXKC(浙)2008-0115,動物生產許可證:SCXK(浙)2007-0005)。

2.2 設備

SPS 2001F型電子天平(梅特勒-托利多(常州)稱重設備系統有限公司);DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海森信實驗儀器有限公司);SHB-ⅢA型循環水式真空泵(河南省太康科教器材廠);RE52-98型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);DGG-9140B型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司);FZ102微型植物試樣粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司);TD25-WS型自動平衡離心機(賽特湘儀離心機儀器有限公司)。

2.3 藥品和試劑

生川烏由長河同春堂藥店提供,經浙江中醫藥大學黃真教授鑒定為毛茛科植物烏頭(Aconitum carm ichaeli Debx)的干燥母根。甲醛(分析純)(批號:20080604,衢州巨化試劑有限公司);無水乙醇(分析純)(批號:0806073601,安徽安特生物化學有限公司);二甲苯(分析純)(批號:20080601,國藥集團化學試劑有限公司);碘酸鈉(批號:20080415,上海銳聰科技發展有限公司)。

2.4 實驗方法及原理

2.4.1 川烏炮制品炮制

(1)未炮制品(即生川烏)。直接取川烏洗凈,晾曬,切片,干燥,粉碎備用。

(2)米醋法炮制。生川烏洗凈,用水浸泡48h,每隔12h換1次水,取出。先將生姜加定量水煮開10min,取汁,然后加米醋,生姜汁(川烏每 50kg,米醋1.25kg,生姜1.25kg)與浸泡后的川烏分別加水共煮90min,取出,晾曬至 6成干,切片,粉碎,備用[3]。

(3)藥典法炮制。生川烏洗凈,浸泡10～48h,至內無干心,取出,加沸水煮 4～6h,切開無白心,口嘗微有麻舌感,取出,切片,粉碎備用[4]。

(4)黑豆法炮制。生川烏洗凈,用水浸泡12h,取出,加黑豆,甘草,生姜(川烏每100kg,用甘草5kg,黑豆 10kg,生姜 10kg),加水煮 2h,取出,除去黑豆,甘草,生姜,晾曬至6成干,切片,干燥,粉碎備用[3]。

2.4.2 烏頭堿提取

川烏粉加水煎煮2～3次,濾液濃縮至 1∶1～1∶2(mL:g),加適量醇,濃度約為 63%,在25℃下靜置(10～48h),濾過;旋轉蒸發儀回收乙醇,得烏頭堿浸膏。浸膏中生藥含量,未炮制組為2.8g/g,醋制組為10.4g/g,藥典法為2g/mL。烏頭堿能溶于水,醇含量50%～60%時淀粉,多糖沉淀[6]。半數致死量(LD50)是藥物、毒物及病原微生物等毒力水平的一個標志。它表示能使全部實驗對象死亡半數的劑量或濃度。由于生物間存在個體差異性,因此LD50需用一批相當數量的實驗對象進行實驗方能測得,并且每種藥物不同實驗對象的LD50值不相同。測定LD50的方法很多,如目測機率單位法、直線回歸法、累計法及序貫法等。由于寇氏法較常用,并有計算簡便,結果較準確等特點,故采用該方法進行計算。當最小劑量組的死亡率為0%,最大劑量組的死亡率為100%時,可按下列公式計算[7]LD50:

當最小劑量組的死亡率大于0%而又小于30%,或最大劑量組的死亡率小于100%而又大于70%時,可按下列校正公式計算LD50:

其中SX50為LD50的標準誤,Xm為最大劑量組劑量的對數值;i為相鄰兩組劑量對數之差;Σ p為各組死亡率之和;P為各組死亡率;q為各組存活率;n為各組動物只數;Pm為最大劑量組死亡率;Pn為最小劑量組死亡率。

2.5 毒性實驗分析

2.5.1 預試

取昆明小鼠80只,雌雄各半,體重 20±2g,隨機分組10組,每組8只。未炮制品和醋制法炮制品分別選擇組距較大的一系列劑量,按組1g/kg樣品溶液給小鼠灌胃,觀察出現的癥狀。實驗結束后采用頸椎脫臼法處死小鼠。

2.5.2 LD50的測定

昆明小鼠80只,雌雄各半,體重 20±2g,隨機分10組,每組8只。根據預試結果,生川烏最高劑量組定為9g/kg,最低劑量組定為3g/kg,劑間比為0.76。醋制法炮制品最高劑量組定為118g/kg,最低劑量組定為36g/kg,劑間比為0.74。將樣品用蒸餾水配置成所需濃度,以0.2mL/10g小鼠體重給以灌胃。觀察統計死亡率,用改良寇式法計算其LD50及其95%可信限。結果見表1。

表1 川烏各炮制品的LD50及95%可信限

從表 1可看出生川烏毒性很強,其 LD50為5.36g/kg,相比其他炮制品的LD50數據可以明顯看出,生川烏的致死劑量極低,而川烏經炮制后,毒性明顯較生川烏低。出現中毒癥狀的劑量大大升高,中毒癥狀也較為減弱。通過實驗可以得出黑豆法炮制后,毒性降低最為明顯,其次是醋制法和藥典法。

2.6 烏頭堿藥效學實驗

2.6.1 熱板法鎮痛實驗

昆明小鼠50只,體重 20±2g,均為雌性,給藥前禁食16h,選取痛閾在10～30s內的小鼠,隨機分五組,分別為生理鹽水對照組、生川烏組、醋制組、藥典組、黑豆組,每組10只。每只小鼠按0.1mL/10g(生藥0.52g/kg,LD50的1/10)分別給藥,空白組給予等體積的生理鹽水,藥液濃度為0.052g/mL。以生理鹽水為空白對照組,測定給藥后 30、60、90、120min的痛閾值。實驗劑量和結果詳見表2。

表2 熱板法鎮痛實驗結果(n=10)

川烏四種不同炮制品對大鼠都具有鎮痛作用,與空白組相比均有極顯著差異,藥典法鎮痛效果在一定時間范圍內逐漸增強,以90～120min最明顯,醋制法的鎮痛效果在一定時間范圍內逐漸減弱,以30～60min最明顯。黑豆法在30min時鎮痛效果較佳,隨著時間延長略有減弱。前60min的鎮痛效果生川烏＞醋制法＞黑豆法＞藥典法,90min～120min的鎮痛效果是生川烏＞藥典法＞醋制法＞黑豆法。黑豆法在前60min時與醋制法相當。

2.6.2 醋酸扭體實驗

昆明小鼠50只,雌雄各半,體重 20±2g,給藥前禁食16h,隨機分5組,分別為生理鹽水對照組、生川烏組、醋制組、藥典組、黑豆組,每組10只。每只小鼠按0.1mL/10g-1(生藥0.52g/kg-1,LD50的1/10)分別給藥,空白組給予等體積的生理鹽水。以生理鹽水為空白對照組,每只小鼠給6%醋酸0.2mL,給藥1h,記錄15min內扭體次數,并計算不同炮制品對扭體反應抑制率,實驗劑量及結果詳見表3。

表3 小鼠醋酸扭體法鎮痛實驗結果 (n=10)

川烏四組不同炮制品對大鼠均具有鎮痛作用,其中醋制法、黑豆法與生理鹽水組有顯著差異,在15min內扭體(腹部收縮內凹,后肢伸展,臀部抬高,蠕動)次數明顯減少。其中黑豆法的鎮痛效果最為明顯,鎮痛強度為黑豆法＞醋制法＞藥典法＞生川烏。

2.6.3 耳腫脹抗炎實驗

昆明小鼠50只,雌雄各半,體重 20±2g,給藥前禁食16h,隨機分5組,分別為生理鹽水對照組、生川烏組、醋制組、藥典組、黑豆組,每組10只。每只小鼠按0.1mL/10g(生藥0.52g/kg,LD50的 1/10)分別給藥,生理鹽水組給予等體積的生理鹽水,以生理鹽水為空白對照組,1h后于小鼠右耳兩面涂0.3mol二甲苯致腫,左側耳朵為對照,1h后處死,用6mm的打孔器沖下左右耳朵相同的部位,在分析天平上稱重,以左右耳片重量差表示腫脹程度,記錄。實驗劑量及結果詳見表4。

表4 抗炎實驗結果(n=10)

四種川烏不同炮制品對大鼠均具有抗炎作用,與生理鹽水組比較有顯著差異。其中黑豆法的抗炎作用最為明顯,其次是藥典法,醋制法和生川烏的抗炎作用比較接近,相對較弱。抗炎作用強度為黑豆法＞藥典法＞生川烏＞醋制法。

3 結語

以上實驗數據顯示,我們可以通過改變川烏炮制工藝從而達到控制川烏炮制品的藥效的目的。川烏不同工藝的炮制品對小鼠熱板試驗具有鎮痛作用,生川烏的毒性最為明顯,藥典法以90～120min最明顯,醋制法以 30～60min最明顯,黑豆法在30min時鎮痛效果較佳,隨著時間延長略有減弱。川烏四組不同炮制品對小鼠醋酸扭體的鎮痛效果以黑豆法最佳,其次是醋制法,再其次是藥典法,作用最弱的是生川烏。

通過本次毒性及藥效實驗發現,川烏的各種炮制品均能明顯抑制二甲苯所制小鼠耳廓腫脹,與生理鹽水組相比有著顯著的差異;醋酸扭體實驗顯示川烏不同炮制品能顯著減少醋酸所致小鼠扭體次數,延長小鼠扭體潛伏期;熱板鎮痛實驗顯示川烏不同炮制品均能延長熱板刺激小鼠添足潛伏期,提高熱板小鼠痛閥值。綜合上述試驗,川烏抗炎鎮痛功效與煎煮時間、添加輔料、給藥劑量等具有顯著相關性。由以上實驗結果,我們初步認為選擇不同炮制輔料、不同浸泡時間、不同炮制時間、不同給藥劑量均對川烏的藥效產生不同影響,為繼續深入研究其工藝條件與藥效的關系,尋找最佳炮制方式,以及合理利用中藥材資源提供了科學根據。

川烏作為一種傳統毒性中藥,常被用于臨床用藥。本實驗采用川烏的炮制品通過灌胃研究不同濃度以及不同炮制品對大鼠肝細胞的毒性來探索出一條切實可行的加工處理方法,提高藥材的質量,保證臨床用藥的安全有效,并且通過細胞毒性的實驗分析方法,驗證不同的炮制品的毒性為選擇最佳炮制品提供科學依據。從實驗結果可以看出,川烏大毒,少量即可起中毒反應,3～4g即可致死,對心肌細胞和肝細胞都有較大損傷。川烏經炮制后毒性明顯降低,小鼠毒性反應強度減弱,以及毒性反應的時間延長。通過以上實驗結果,我們可以通過改變炮制工藝使得川烏毒性大大降低的同時使其藥效達到最佳,便于醫生的合理用藥及病人的安全用藥。

[1]國家食品藥品質量監督管理局.中華人民共和國國藥典[R].北京:國家食品藥品質量監督管理局,2000.

[2]孟瓊華,彭 成.烏頭堿對心肌細胞毒性作用機制研究[D].成都:成都中醫藥大學,2004.

[3]Xu C J.Science of p rocessing Chinesemedicnal herbs(中藥炮制學)[M].Shanghai:Shanghai Science Press,1985.

[4]鄭 平,楊煜榮.烏頭堿鎮痛作用部位及其與中樞去甲腎上腺素能系統的關系[J].中國藥理學報,1988,9(6):485.

[5]甄 攀,楊鳳珍.吳茱萸總生物堿提取條件的考察[J].中國中藥雜志,2000,25(8):50～54.

[6]陳 奇.中藥藥理研究方法學[M].北京:人民衛生出版社,1996.