呂寶軍 謝小銘 譚 敏

1．中山大學附屬第五醫院普外II區，廣東 珠海 519000;2．中山大學附屬第五醫院急診科，廣東 珠海 519000;3．中山大學附屬第一醫院微創外科，廣東 廣州 510080

自80年代開始，世界各國科學家，均深入研究了鯊魚軟骨的臨床應用，并取得了令人矚目的成就［1]。中華鱘昵稱“水中熊貓”是一種在海洋中生長，在淡水中繁殖的大型海河洄游性軟骨硬鱗魚類，除了頭部有幾塊膜化骨之外，全身都是軟骨［2]。我們擬從中華鱘軟骨分離得到中華鱘軟骨活性制劑，通過體內體外實驗對其抗腫瘤效應進行了初步的研究，為我國生物醫藥的發展及寶貴資源的發掘開辟了一條新路。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑 中華鱘 (順德市創世紀農業園饋贈)、Millipore超濾器 (5，000和100，000)(Amicon公司)、健康三級純系 BALB/c－nu裸小鼠 (雌性、體重相近20±0.2g、約6－7周齡)(中山大學實驗動物中心)、人結腸癌lovo細胞株 (中山大學實驗動物中心)。

1.2 中華鱘軟骨有效成分的抽提、分離和濃度的測定 剖取200g中華鱘軟骨，將中華鱘軟骨用組織粉碎機粉碎至勻漿，經400ml1M鹽酸胍抽提48h，45% ～65%丙酮的分級沉淀，5，000分子量和100，000分子量的Millipore超濾器等步驟超濾得到中華鱘軟骨溶液a(全成份)、中華鱘軟骨溶液b(≥100，000分子量)、中華鱘軟骨溶液c(5，000～100，000)三種溶液，通過Bradford法測定中華鱘軟骨溶液蛋白質的濃度。

1.3 體外抑制血管生成作用的實驗研究 (付生法［3])濾紙放入打孔器中制作直徑1mm的濾紙片，高溫高壓消毒備用，將40只受精雞蛋表面酒精消毒后放入37.8℃孵化箱，孵化至第7天時，暴露出絨毛尿囊膜，將已經消毒的濾紙小片放入中華鱘軟骨溶液a、中華鱘軟骨溶液b、中華鱘軟骨溶液c中浸濕后，部分放入生理鹽水中，分別選取10只雞胚，依次用小鑷子夾取a、b、c溶液以及生理鹽水中的濾紙片放入絨毛尿囊膜血管較少的部位作為a組、b組、c組、生理鹽水組，孵化2天后揭除透明膠帶取膜制作標本，將制作的標本攝像血管計數，以給藥點為中心，以半徑間隔5mm將雞胚絨毛尿囊膜劃分為3個區域，計數各區域的主血管數的總和。

1.4 中華鱘軟骨活性成分抑制荷結腸癌裸鼠腫瘤生長的體內實驗 設8組，中華鱘軟骨溶液a灌喂組和腹腔注射組、中華鱘軟骨溶液b灌喂組和腹腔注射組、中華鱘軟骨溶液c灌喂組和腹腔注射組、生理鹽水灌喂組和腹腔注射組8組，每組10只，灌喂劑量0.2ml，腹腔注射同上，接種第二天開始每日一次共用藥14天，人結腸癌lovo細胞懸液調整濃度為1×107/ml，每鼠右腋皮下接種0.2ml，用藥14天后用頸椎脫臼處死小鼠，解剖并完整的分離出皮下瘤塊，稱瘤重，計算平均瘤重和抑瘤率。抑瘤率 (%)=對照組平均抑瘤率－試驗組平均抑瘤率/對照組平均抑瘤率×100%。

2 結果

2.1 超濾所獲得的中華鱘軟骨粗溶液a、b、c的濃度分別是 12.389mg/ml、34.048mg/ml、0.221mg/ml，見表 1。

表1 中華鱘軟骨溶液OD值與濃度的關系表

2.2 中華鱘軟骨活性成分抑制血管生成的體外實驗研究目前，公認的血管生長抑制模型有兩種，即兔角膜誘生新生血管抑制模型和雞胚絨毛尿囊膜血管生長抑制模型。我們應用后一種模型來檢測軟骨蛋白的活性，結果表明，生理鹽水組血管生長良好，血管分支適中，中華鱘軟骨溶液a、b、c與生理鹽水對照相比，軟骨對血管生成有明顯的抑制作用，血管分支減少，尤其以溶液c抑制效果較顯著，結果如表2、圖1所示。計數各處理組及各區域的主血管數，a組平均主血管數為 (21.52±3.64)，相對于生理鹽水平均主血管數 (33.84±3.14)差異顯著 (t=2.47，P＜0.05);b組平均主血管數為 (28.41±2.13)，與生理鹽水組對照差異不顯著 (t=2.03，P＞0.05);c組平均主血管數為 (7.16±1.31)，相對于生理鹽水平均主血管數有統計學差異 (t=4.92，P＜0.05)。

表2 三組中華鱘軟骨溶液抑制血管生成的各區域的主血管數 (x±s條)

2.3 如表3所示，中華鱘軟骨溶液a腹腔注射組和灌喂組的平均瘤重分別為 (0.41±0.06)、(0.53±0.03)，相對于生理鹽水注射組和灌喂組的平均瘤重 (0.52±0.08)、(0.56±0.04)腹腔注射組有所降低，且P＜0.05有統計學意義。中華鱘軟骨溶液c腹腔注射組和灌喂組的平均瘤重分別為 (0.31±0.09)、(0.53±0.05)，相對于生理鹽水注射組和灌喂組的平均瘤重，腹腔注射組有所降低并且P＜0.01有統計學意義。中華鱘軟骨溶液b腹腔注射組和灌喂組的平均瘤重分別為 (0.46±0.07)、(0.59±0.06)，相對于生理鹽水注射組和灌喂組的平均瘤重P＞0.05無統計學意義。結果表明，中華鱘軟骨溶液對荷lovo結腸癌裸鼠腫瘤的生長具有抑制作用。中華鱘軟骨溶液a、溶液c以腹腔注射的方式對lovo結腸癌的生長具有一定得抑制作用，尤其以溶液c抑制效果較為顯著。

表3 中華鱘軟骨對荷lovo結腸癌裸鼠腫瘤生長的抑制效應

3 討論

動物軟骨是一種特殊的結締組織，由軟骨細胞、纖維和基質構成。軟骨中含有大量的粘多糖、胺基糖及豐富的活性蛋白，其中有多種抗腫瘤有效成分，如血管生成抑制因子、抗入侵因子和腫瘤細胞因子等［4]。軟骨血管抑制因子直接來源于動物組織，無明顯的毒副作用，它與其他血管抑制劑不同，對人正常細胞無抑制作用，能夠特異的抑制血管內皮細胞的增殖和遷移，與內皮生長抑制素相比，僅用1/10的量，具有明顯高效的抑瘤率［5]。由于中華鱘人工繁殖和飼養的成功，與小牛軟骨來源和鯊魚來源的血管生成抑制因子相比，它的原料來源豐富。由于軟骨是生物機體主要的無血管組織，多年來，人們希望從中提純血管生成抑制因子，然而軟骨組織含有豐富的酸性年多糖等生物大分子，使得從中提取上述活性物質尤其困難。血管生成是腫瘤持續生長和發生轉移的必要前提，在生長初期，腫瘤細胞可以通過擴散從細胞間隙獲得營養和氧氣，但當腫瘤增至1－2mm3時，內部的細胞通過擴散不能獲得足夠的氧氣和營養滿足其繼續生長和分裂的需要，腫瘤內部形成缺氧狀態，這時缺氧作為一種環境信號啟動了瘤細胞中血管內皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子等血管生成正調控因子的表達，使腫瘤具有了促血管生成表型。腫瘤內形成的血管提供了氧氣和營養，也同時提供了腫瘤轉移的通路。如果腫瘤血管生成被抑制，就切斷了腫瘤生長所需的氧氣和營養供應，同時也切斷了腫瘤轉移的重要通路，使腫瘤處于無癥狀休眠狀態，再聯合其他手段就有可能徹底治愈腫瘤，這就是通過抑制血管生成治療腫瘤的理論基礎［6]。

我們通過粗略地將中華鱘軟骨分成幾個組分，通過體外實驗檢驗對比各組分抑制血管生成的作用，發現軟骨c組分對血管的生成和腫瘤的增殖具有明顯的抑制作用，證明了中華鱘軟骨內含有高效的血管生成抑制成分。

由于中華鱘軟骨中含有豐富的血管生成抑制因子，能夠抑制腫瘤血管生成而抑制腫瘤的生長和轉移，并且中華鱘軟骨中含有豐富的酸性粘多糖，能夠刺激機體免疫功能，增強機體抗腫瘤抗病能力。因此，我們認為中華鱘軟骨制劑具有抗腫瘤作用，關鍵是應該建立合理的制備工藝，有效提取軟骨抗腫瘤活性成分－血管生成抑制因子，同時剔除軟骨中存在的抗腫瘤有害成分－血管生成刺激因子和腫瘤細胞生長刺激因子。因此，從中華鱘軟骨中純化制備血管生成抑制因子應用于抗血管生成新藥的開發，具有重要意義。

［1]Mefly L，Simjee S，Smith SL．Induction of inflammatory cytokines by cartilage extracts［J]．Int Immunopharmacol，2007，7(3)：383 －391．

［2]吳立人．“保護中華鱘”的科技實踐活動．生物學教學，2010，35(4)：49－51．

［3]付生法，陸應麟，張朝山等．檢測血管生長因子作用的雞胚絨毛尿囊膜技術．軍事醫學科學院院刊，1993，17(4)：294－296．

［4]尚俊英，謝裕安，楊帆，等．鯊魚軟骨低分子蛋白的提取及其抑制新生血管形成的初步研究．廣西醫學，2008，30(2)：156－158．

［5]余新威，羅紅宇，徐佳晶，等．赤魟軟骨新生血管抑制組分的制備及其活性的初步研究．浙江海洋學院學報：自然科學版，2007，26(2)：147－149．

［6]Rabbani－Chadegani A，Abdossamadi S，Bargahi A，et al．Identification of low－molecular－weight protein(SCP1)from shark cartilage with anti－angiogenesis activity and sequence similarity to parvalbumin．J Pharm Biomed Anal，2008，46(3)：563－567．