苦參堿體外誘導人結腸腺癌SW480細胞凋亡的實驗研究

唐學敏，焦河玲，朱 艷

（南陽理工學院張仲景國醫學院，河南 南陽 473000）

苦參堿（MT）是中藥苦參的主要有效成分，屬于四環的喹諾里西啶類（quinolizidine），分子式為C15H24N2。大量的藥理和臨床研究發現，MT具有抗炎、抗病毒、抗纖維化、免疫調節等多種藥理作用，并且其抗腫瘤的作用越來越得到重視。本文針對人結腸腺癌細胞SW480增殖及細胞凋亡方面的影響，探討其對結直腸癌可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及儀器

苦參堿（寧夏鹽池制藥廠，批號071101），注射用環磷酰胺（CTX，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號09031521），小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），Hoechst-33258染色試劑盒，Annexin VFITC細胞凋亡檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所），TRIzol（Invitrogen 公司）、SYBR PrimeScript Real TimeRT-PCR kit（大連 TaKaRa生物工程公司），其他試劑均為國產分析純。450型酶標儀、日本RICOH公司，倒置相差顯微鏡、日本 OLYMUPS公司，FACSCalibur流式細胞儀（美國 Becton Dickinson公司）。

1.2 細胞培養

人結腸腺癌細胞株SW480由中山大學細胞中心提供，使用含有體積分數為10％的胎牛血清的RPM I-1640培養液，在37℃和5％CO2實驗條件下常規培養，于指數生長期用不同濃度的藥物處理相應時間后進行檢測。

1.3 MTT法檢測 MT對SW480細胞增殖影響

取指數生長期的細胞加入96孔板中，每孔6000個細胞 180μl。細胞貼壁后加入不同濃度的 MT 20μl，使其終濃度分別為 0.01、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80和1.6 0mg/ml，每個濃度設3個平行孔，同時設置空白對照組、溶劑對照組和調零孔。分別培養24 h、48 h，用 MTT法測490nm波長處吸光度（OD）值，并按下列公式計算細胞增殖抑制率：生長抑制率（％）=（1－用藥組 OD值/對照組 OD值）×100％。按Bliss法求出半數抑制濃度（IC50值）。

1.4 光鏡觀察

將SW480細胞培養于玻片上，加入終濃度為0.35，0.70mg/mlMT以及不含藥物的等體積 RPM I-1640培養液（對照組），分別培養24h和48h后光鏡觀察并拍照。

1.5 染色觀察

以PBS洗上述各組細胞2次，70％乙醇4C固定 5min，PBS沖洗，Hoechst-33258染色 10min熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.6 流式細胞儀測定SW480細胞凋亡率

以 0.7mg·mL－1藥物作用細胞 24h、48h 后，以0.25％胰蛋白酶消化細胞制成單個細胞懸液后調制細胞濃度至2×106·mL－1細胞，分別進行流式細胞儀檢測凋亡率。

1.7 熒光實時定量PCR法檢測 Caspase 3、Bcl-2的轉錄表達水平

表 1顯示，以 0.7mg·mL－1藥物作用細胞 24h、48h后，Trizol法提取各組的 Total RNA，按照反轉錄試劑盒（PrimeScriptTM RT reagent Kit，Takara）的操作說明書，將 mRNA逆轉錄為 cDNA。按照 QPCR試劑盒（SYBR Premix EX TaqTM，Takara）的操作說明書，QPCR檢測 Caspase 3及 Bcl-2 mRNA的轉錄表達水平?？醇一颚?actin作為內參，用相對定量方法（ΔΔCT）來計算分析各組 Caspase 3、Bcl-2的轉錄表達水平。

Table 1 Primer set used for real-time PCR

1.8 統計學處理

所有數據采用SPSS 13.0統計軟件進行處理，實驗數據用 珋x±s表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 LSD法，方差不齊的采用Tamhanes T2法。

2 結果

2.1 MTT法測定MT對SW480細胞增殖的影響

圖1顯示，MTT法檢測不同濃度的苦參堿作用于人結腸腺癌SW480細胞不同時間，對細胞增殖的抑制作用如圖1。結果表明，MT能顯著抑制 SW480細胞的增殖，并有明顯的劑量效應及時間效應關系。

2.2 光鏡觀察結果

圖2顯示，經0.35mg/mlMT作用48h后 SW480細胞細胞逐漸變為圓形，體積縮小，培養液中出現少量漂浮細胞，0.70mg/ml作用后上述改變更為明顯，正常對照組細胞則未見明顯改變。

2.3 MT對 SW480細胞凋亡的影響

圖3顯示，經 0.35，0.7mg/mlMT作用 48 h后凋亡細胞Hoechst-33258熒光染色較未凋亡細胞增強并出現核固縮。圖4顯示，經0.7 mg/mlMT作用后，24h組及48 h組第4象限即早期凋亡細胞數增多，凋亡率分別達22.08％和34.48％，并出現了晚期凋亡現象，空白對照組第1象限細胞數量則較多，細胞凋亡率低于6.0％。

2.4 MT對 SW480細胞 Caspase 3、Caspase 9及 Bcl-2表達的影響

圖5A顯示，SW480細胞經0.7mg/ml MT作用后，其 24h組及 48 h組 Caspase 3、Caspase 9 mRNA表達升高。圖5B顯示，Bcl-2表達則降低相對于對照組降低達41.08％，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 對細胞增殖的抑制作用

圖2 光鏡下各組SW480細胞A.Control group；B.MT group 24h；C.MT group 48h

圖3 Hoechst-33258染色下各組SW480細胞A.MT group 48h；B.MT group 24h；C.Control group

圖4 各組SW480細胞AnnexinⅤ-FITC檢測結果A：Control group；B：MT group 24h；C：MT group 48h

4 討論

大腸癌是全球發病率居第三位的常見腫瘤，其發病率一直呈上升趨勢。目前，針對大腸癌的化療方案主要是以5-Fu為主的綜合化療，其毒副反應大。中藥以其獨特的抗腫瘤療效、不良反應少等特點，已引起世界各國科研工作者的關注。體外實驗表明，苦參堿對多種腫瘤細胞有抑制或殺傷作用，對HepG2、K562、HL260有明顯的抑制作用，并能誘導分化和凋亡［1］。Hua Jiang 等［2］人的研究表明，苦參堿可誘發細胞色素 C釋放，激活 caspase-3和caspase-9，從而通過線粒體途徑誘導 K562細胞凋亡。體內試驗也表明［3］，苦參堿不僅抑制人胃癌細胞株裸鼠移植瘤的生長，還能增強5-FU的抑瘤能力?？鄥A對SW620結腸腺癌細胞具有明顯的誘導凋亡作用，是很有潛力的抗癌藥物［4］。

圖5A Caspase 3mRNA熒光定量PCR相對定量，與對照組相比 P＜0.05

圖5B Bcl-2 mRNA熒光定量PCR相對定量，與對照組相比 P＜0.05圖5 MT作用SW480后Caspase 3、Bcl-2 mRNA熒光定量PCR相對定量

本實驗以MTT法測定MT對人結腸腺癌SW480細胞株的增殖抑制作用，確認其48 h增殖抑制活性IC50為0.7 mg/ml。眾所周知，腫瘤細胞在增殖過程中受到多種因素影響，而誘導腫瘤細胞凋亡在腫瘤發生、發展及其治療中起重要作用。人們在檢測細胞凋亡的多種方法中，主要是根據凋亡細胞的形態特征、生化代謝及生物水平上發生的改變來進行分析。一般認為，形態學變化是判斷凋亡的基礎［5］。我們采用光學顯微鏡觀察 MT對 SW480的影響，可見細胞核固縮、核碎裂、細胞膜起泡等形態。Hoechst-33258染色及流式細胞儀分析結果證明，MT可誘導SW480細胞凋亡，其凋亡現象顯示時間依賴性增加。

國內外許多學者對腫瘤發生機制進行了深入的研究，發現許多凋亡基因的相關性，其中以 Caspase-3家族和 Bcl-2家族最為關注［6、7］。Caspase為半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase）的簡稱，是一組具有相似氨基酸序列的半胱氨酸蛋白酶，它除了參與細胞因子成熟，細胞生長和分化之外，還與細胞凋亡緊密聯系［8］。Caspase級聯反應在凋亡通路中處于重要地位，尤其是Caspase-3是其中的中心環節，也是細胞凋亡的主要參與成分［9～11］。Bcl-2是一種新型的原癌基因，Bcl-2蛋白對不同因素引起的細胞凋亡均有抑制作用，在各種正常細胞的發育過程中表達，而在成熟或走向凋亡的細胞中不表達或低表達［12］。本實驗結果顯示，經0.7 mg/m MT作用 24、48h后 SW480細胞的Caspase-3 mRNA水平增高，Bcl-2 mRNA水平下降，說明 MT可通過影響凋亡基因 Bcl-2和 Caspase-3的表達使 SW480細胞凋亡，發揮其抗腫瘤作用。這可能是誘導細胞凋亡的重要機制之一。

大量實驗研究證明，包括很多中藥提取物在內的多種抗癌藥物的抗癌作用涉及到多種基因及通路的相互影響，最終通過受表達的蛋白來實現［13］。我們將在今后更深入地探討MT誘導結腸腫瘤細胞凋亡的分子機制，并進一步進行動物體內實驗證實療效，為開發和利用苦豆子資源提供實驗依據。

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