不同濃度血管緊張素Ⅱ對人臍靜脈血管內皮細胞衰老和P-選擇素表達的影響

王雪妮 劉凌 劉澤 王魯妮 吳軍 王偉 封菊香

血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是腎素-血管緊張素系統中最重要的活性物質，它通過與受體相結合發揮相應的生理、病理作用，如血管平滑肌收縮、動脈血壓升高等，可繼發性引起動脈粥樣硬化。但有研究發現，AngⅡ能刺激血管自由基的產生，促進血管內皮細胞炎癥反應和功能障礙，加速血管內皮細胞衰老，參與動脈粥樣硬化發生和發展的過程［1］，提示AngⅡ參與動脈粥樣硬化可能有另外其他的機制。P-選擇素屬于細胞黏附分子中的選擇素家族，是內皮細胞損傷及血小板活化的特異性指標，可能參與動脈硬化的早期階段［2］。本研究以建立AngⅡ誘導人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)衰老模型，觀察AngⅡ對內皮細胞衰老及P-選擇素表達的影響，探討AngⅡ在動脈粥樣硬化的發生、發展中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人臍靜脈血管內皮細胞株HUVEC由廣州軍區廣州總醫院醫學實驗科提供;RPMI1640培養基、胎牛血清購自美國HYCLONE公司;AngⅡ、CCK-8購自美國Sigma公司;Human's P-selectin Platinum ELISA試劑盒購自美國eBioscience公司;細胞周期流式細胞分析試劑盒、細胞衰老特異性β-半乳糖苷酶(β-gal)檢測試劑盒購自上海杰美公司;倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)，酶標儀(Tecan Genios，瑞士)，流式細胞儀(Miltenyi公司，德國)。

1.2 HUVEC的培養 HUVEC細胞株貼壁生長于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，置于5%CO2、37℃培養箱中培養，每2 d換液1次維持細胞良好生長狀態。待細胞長至融合時用0.25%胰蛋白酶消化、傳代。HUVEC呈多角形，單層鋪路石樣緊密排列。

1.3 不同濃度AngⅡ誘導HUVEC衰老 將細胞(2.5×104個/孔)接種于24孔板中，每孔加入普通全培養基1 ml培養過夜。隨機分為5組，分別為對照組及不同濃度AngⅡ組(10-8～10-5mmol/L)。待細胞長至亞融合時無血清培養12 h，使細胞達到同步化。棄去原培養液，對照組加入1 ml普通全培養液，藥物組分別加入1 ml含不同濃度AngⅡ的全培養基，持續刺激48 h，第12 h和24 h各補充1次AngⅡ，建立AngⅡ誘導的HUVEC衰老模型［3］。

1.4 β-gal檢測法檢測細胞衰老情況 根據細胞衰老特異性β-gal檢測試劑盒操作方法，將原培養板里的培養液棄去，每孔加入500 μl清理液，清洗細胞表面，棄去清理液后加入500 μl固定液室溫下孵育5 min，抽去固定液，加入500 μl酸性液清洗細胞表面，再重復清洗1次后，每孔加入400 μl染色工作液，放入37℃培養箱中培養12 h后，在倒置顯微鏡下觀察和計數。

1.5 流式細胞術分析衰老細胞周期變化情況 依據細胞周期流式細胞分析試劑盒說明，用PBS沖洗細胞表面2次，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化收集約106個細胞，放入離心機離心5 min，速度為300 g;抽去上清液后，加入1號工作液500 μl輕輕混勻細胞，暗室里室溫下孵育60 min后，加入2號工作液500 μl混勻，過篩后立刻上機檢測進行細胞流式周期分析。

1.6 CCK-8法檢測細胞存活率 細胞以5000個/孔接種于96孔板中，按上述造模方法誘導細胞衰老后，向每孔加入CCK-820 μl培養1 h，酶聯免疫檢測儀在450 nm下測定各孔OD值，以藥物組與對照組OD值百分比代表細胞增殖率。每組設4復孔，重復3次。

1.7 ELISA檢測培養基上清中P-選擇素含量 將細胞(2.5×104個/孔)接種于24孔板中，每孔加入普通全培養基1 ml培養過夜。隨機分為5組，分別為對照組及不同濃度AngⅡ組(10-8～10-5mmol/L)，按照上述方法誘導細胞衰老后，取細胞培養液上清離心，再收集上清置于-20℃保存，然后按Human's P-selectin Platinum ELISA試劑盒說明操作，置于酶標儀在450 nm處測定吸光度，每組設3復孔，重復2次。

1.8 統計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。數據以平均數±標準差(±s)表示，計量資料比較采用單因素ANOVA(方差分析)，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 衰老相關β-gal活性 β-gal是一種鑒別細胞衰老的生物學標志［4］。β-gal染色結果顯示，不同濃度AngⅡ處理HUVEC 48 h后，對照組幾乎不表達β-gal(1.02±1.15)%，濃度為10-8～10-5mmol/L藥物組細胞β-gal染色陽性百分率分別為(25.94±2.58)%、(51.37±2.76)%、(79.80±2.83)%、(91.81±1.53)%，與對照組相比，細胞衰老的數量隨著AngⅡ濃度的增加逐漸增多(P均＜0.01)。

2.2 細胞周期分析 流式細胞儀分析顯示，HUVEC在不同濃度AngⅡ培養液中孵育48 h后，隨著AngⅡ濃度的升高，G0/G1期細胞百分率逐漸增多，S期細胞百分率逐漸減少。與對照組相比，10-8和10-7mmol/L AngⅡ組無明顯差異，10-6和10-5mmol/L AngⅡ組有統計學差異(表1)。

表1 不同濃度AngⅡ對細胞周期的影響(±s，%)

表1 不同濃度AngⅡ對細胞周期的影響(±s，%)

注:與對照組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 G0/G1期 S期對照組＊＊50.76±2.77 43.98±1.8310-8mmol/L組 53.58±2.25 38.64±1.6810-7mmol/L組 54.44±2.38 37.13±1.5210-6mmol/L組 58.26±2.89* 34.68±1.13*10-5mmol/L組 62.37±2.42＊＊ 29.15±1.95

2.3 細胞存活率變化情況 經不同濃度AngⅡ培養48 h后，CCK-8法檢測表明藥物組存活細胞數與對照組相比明顯下降(P均＜0.01);并隨AngⅡ濃度增高，細胞存活率逐漸下降(圖1)。

圖1 不同濃度AngⅡ培養后存活細胞數

2.4 P-選擇素表達含量的變化 對照組的P-選擇素表達含量為(2.47±0.06)ng/ml，含不同濃度 AngⅡ(10-8～10-5mmol/L)組P-選擇素含量分別為(39.68±0.35)ng/ml、(41.70 ± 0.45)ng/ml、(71.25 ± 0.29)ng/ml、(79.89 ±0.28)ng/ml，與對照組相比，隨著 AngⅡ濃度的增加，P-選擇素表達含量明顯增多(P均＜0.01)。

3 討論

流行病學研究顯示，年齡是動脈粥樣硬化性疾病的主要危險因素之一，越來越多研究表明血管內皮細胞衰老在動脈硬化疾病的發病中起著重要的作用，衰老的血管內皮細胞會發生形態和功能上的變化，引起內皮功能障礙及血管壁結構的改變，血管內皮功能障礙是動脈粥樣硬化的始動因素，導致動脈粥樣硬化的發生和發展［5］。有研究顯示，在動脈粥樣硬化斑塊內檢測出較強的衰老相關β-gal活性，表明內皮細胞衰老與動脈粥樣硬化的發生密切相關。本實驗結果顯示AngⅡ不同濃度組內皮細胞衰老相關β-gal活性與對照組相比明顯增高，且呈濃度依賴性;而細胞周期及存活率的變化隨著AngⅡ濃度的變化有逐漸降低的趨勢，提示AngⅡ可呈劑量依賴性直接誘導內皮細胞衰老。

P-選擇素是一種存在于血小板a顆粒及內皮細胞Weibel-Palade體中細胞表面黏附分子，它能夠介導白細胞和血小板在內皮細胞上黏附、聚集、活化并釋放炎性遞質，參與炎癥過程，可作為血小板活化和內皮細胞功能受損的重要分子標志物。本研究發現，AngⅡ作用于內皮細胞后能引起P-選擇素的表達。有研究顯示，P-選擇素可以直接作用于小鼠血管內皮，引起炎癥反應或血栓形成，導致血-腦屏障功能障礙及動脈粥樣硬化，最終導致心腦血管疾病的發生［6］。本實驗中AngⅡ不同濃度組的P-選擇素的表達與對照組相比明顯增加，并隨著AngⅡ濃度的增加，P-選擇素的表達逐漸增加，AngⅡ(10-5mmol/L)組作用于內皮細胞后P-選擇素的表達達到高峰并維持在較高水平。這些結果提示AngⅡ可以通過增強P-選擇素的表達調節血管壁的炎癥反應參與動脈粥樣硬化的發生。

有研究發現，AngⅡ通過氧化應激和激活凋亡信號能明顯減少內皮祖細胞的數量、阻礙受損細胞集落形成和影響細胞遷移，與本實驗結果特點相符，表明AngⅡ能直接誘導血管內皮細胞衰老及P-選擇素的表達并呈劑量依賴性，但其作用機制仍需進一步研究證實。

［1］Kunieda T，Minamino T，Nishi J，et al.AngiotensinⅡ induces premature senescence of vascular smooth muscle cells and accelerates the development of atherosclerosis via a p21-dependent pathway［J］.Circulation，2006，114(9):953-960.

［2］Blake GJ，Ridker PM.Novel clinical markers of vascular wall inflammation ［J］.Circ Res，2001，89(9):763-771.

［3］單海燕，白小涓，劉強，等.血管緊張素II誘導血管內皮細胞衰老的形態學研究［J］.中國動脈硬化雜志，2007，15(3):161-164.

［4］Dimri GP，Lee X，Basile G，et al.A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92(20):9363-9367.

［5］Minamino T，Komuro I.Vascular cell senescence contribution to atherosclerosis［J］.Circ Res，2007，100(1):15-26.

［6］Kisucka J，Chauhan AK，Zhao BQ，et al.Elevated levels of soluble P-selectin in mice alter blood-brain barrier function，exacerbate stroke，and promote atherosclerosis［J］.Blood，2009，113(23):6016-6022.