γ輻照對枯草芽孢桿菌營養體的損傷

陳曉明，柳 芳，鄭 春，李曉燕，張建國，嚴萬里

（1.西南科技大學 生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010；2.中國工程物理研究院 核物理與化學研究所，四川 綿陽 621900）

自1956年美國Ethicon公司首次應用電子直線加速器對外科縫線的滅菌成功后，電離輻射滅菌技術迅速發展。電離輻射通過電離激發作用，改變各種生物大分子的結構功能，從而改變細胞功能、代謝、結構，以及機體組織、器官、系統及其相互關系，最終導致機體的損傷［1］。枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）是一種革蘭氏陽性菌，能產生對熱、紫外線、電離輻射和某些化學藥品有很強抗性的芽孢，在醫藥衛生中常被作為熱力、高壓、電離輻射滅菌的指示菌。芽孢對電離輻射的耐受性較強，高劑量下的存活率也較高［2－3］，目前輻照滅菌主要集中研究電離輻射對芽孢的損傷效應，對營養體的相關研究較少。實際上枯草芽孢桿菌也常以營養體的形式存在，因此考查電離輻射對營養體的損傷效應具有十分重要的現實意義。本實驗通過對細胞存活率、超氧化物岐化酶（SOD）活性及DNA雙鏈斷裂水平的研究，考查γ輻照對枯草芽孢桿菌營養體的損傷效應，旨為輻射滅菌效應和機理的深入研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌黑色變種（Bacillussubtilisvar.niger，ATCC 9372），購于中國普通微生物菌種保藏中心。

1.2 枯草芽孢桿菌營養體制備

營養瓊脂培養基（NA培養基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，定容至1 000mL）培養菌體，37℃，160r／min振蕩培養16h，按10%比例接入新培養基，繼續培養12h，離心收集菌體，PBS（無水磷酸氫二鈉2.83g，磷酸二氫鉀1.36g，蒸餾水1 000mL）洗滌1次，PBS復溶。分裝于2mL凍存管（PP材料）。

1.3 輻照處理

本研究按γ輻照吸收劑量設置50、200、800、1 400、2 000Gy和空白對照共6個處理，每個處理3個重復，吸收劑量率為15Gy／min。γ輻照在中國工程物理研究院核物理與化學研究所的60Co源上進行。輻照后樣品分為3份，分別進行細胞計數、胞內SOD活性測定和DNA雙鏈斷裂水平檢測。

1.4 細胞存活率檢測

采用平板計數的方法檢測細胞存活率。取100μL樣品加入至900μL PBS中進行倍比稀釋，振蕩混勻后取100μL到NA固體培養基上涂板，于37℃恒溫箱倒置培養48h計數，以菌落數在30～300之間為有效數據。細胞存活率＝輻照后活菌數／輻照前菌數。

1.5 胞內SOD活性測定

輻照樣品離心棄上清，加入等量溶菌酶液（4mg／mL），于37℃下溫育30min，超聲處理25min，5 000r／min×10min，4℃離心取上清即為粗酶液。胞內SOD活性測定采用黃嘌呤氧化法（南京建成試劑盒）。用酶標儀（Thermo，Multiskan spectrum）測定550nm 處吸光值。規定每毫升反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為1個SOD活力單位（U）。

1.6 DNA雙鏈斷裂分析

DNA雙鏈斷裂水平（DSB）檢測選用脈沖場凝膠電泳（PFGE）法。脈沖場電泳樣品的制備及電泳條件參照文獻 ［3－4］。標準DNA采用225kb～2.2Mb的酵母染色體DNA（Bio－Rad公司產品）。用Quantity one軟件分析各泳道DNA熒光強度，DNA的釋放百分比值（PR）定義為各泳道中已移出加樣孔的DNA熒光強度所占該泳道中總DNA熒光強度比值。采用平均分子量法［5］計算DNA斷裂產額L（DSBs／kb），定量DNA斷裂水平，則：

式中：m為細胞中線狀雙鏈DNA分子的條數；X為DNA分子的總長，Mbp；PR為輻照后產生的DNA片段釋放百分比與對照的差值；T為DSB片段平均大小，Mbp。

2 結果與分析

2.1 γ輻照對枯草芽孢桿菌營養體的滅菌效果

枯草芽孢桿菌營養體受到吸收劑量為50～2 000Gy的γ輻照后，細胞存活率隨劑量不斷下降（圖1）。運用SPSS 10.0對存活率作回歸分析，得到方程y＝－0.635－0.001x，R2＝0.831（y為存活率的對數值；x為γ輻照吸收劑量，Gy）。根據方程求出D10＝365Gy（D10為被輻照物中的細菌總數降低到原始值1／10時所需的吸收劑量，它反映了細菌對電離輻射的耐受能力）。從圖1可看出，在低劑量輻照（≤800Gy）時，存活率隨著輻照劑量急劇下降，在800Gy劑量時，存活率為0.25%，當劑量大于800Gy時，存活率下降趨勢較為平緩。

本研究之前采用γ輻照枯草芽孢桿菌芽孢樣品，得到輻照吸收劑量與細胞存活分數之間的關系滿足方程y＝ －0.000 37x，R2＝0.951 3，D10為2 700Gy。對D10水平比較，γ輻照營養體的滅菌效果約是芽孢樣品的7.4倍。

圖1 γ輻照對枯草芽孢桿菌的滅菌效果Fig.1 Sterilizing effect ofγ－rays on Bacillus subtilis vegetative cells

2.2 γ輻照對枯草芽孢桿菌營養體胞內SOD活性的影響

不同劑量γ輻照對枯草芽孢桿菌胞內SOD活性影響顯著（圖2）。枯草芽孢桿菌經γ輻照后，胞內SOD活性均顯著低于對照（p＜0.01）。由圖2可見，當輻照劑量為50Gy時，胞內SOD活性最低，僅為對照的54.9%，而200Gy輻照下酶活性明顯上升，隨著劑量的繼續增大，酶活性先降低后升高。輻照劑量大于800Gy時，SOD活性隨劑量持續升高（p＜0.01）。對于SOD活性隨劑量的這種奇怪變化現象，推測可能與γ輻照對胞內SOD活性的影響受到多種因素的調節有關。首先，SOD作為抗氧化體系中的成員，其活性受到其他抗氧化酶表達的影響；另外，高劑量下SOD酶活性隨輻照劑量的增大而升高的現象可表明SOD活性還可能受到自由基的影響，隨劑量增大累積較多自由基，誘導細胞SOD的表達功能增強，使胞內SOD活性不斷上升。對于上述推測有待進一步研究確認。

圖2 γ輻照對枯草芽孢桿菌胞內SOD活性的影響Fig.2 Effect ofγ－rays on Bacillus subtilis SOD activity

2.3 γ輻照誘導的枯草芽孢桿菌DSB水平

分析輻照后DNA單雙鏈斷裂情況具有很大價值［6］。圖3所示為輻照樣品脈沖場凝膠電泳圖。由圖3可看出，隨著輻照劑量的增大，加樣孔附近的熒光條帶逐漸減弱并最終消失，同時條帶末端小分子量的熒光逐漸加強，即隨著γ劑量的增大，大分子片段不斷減少而小分子片段逐漸增加。

用Quantity one軟件分析圖3中條帶的熒光強度，并計算PR與L。圖4a和b分別為PR與L隨γ劑量的變化關系。由圖4可看出，PR和L均隨劑量不斷增大并逐漸趨于飽和。這與Cedervall等［7］的結果一致。對PR及L分別進行回歸分析，PR滿足方程y＝－44.517＋13.998lnx，R2＝0.952（y為DSB的釋放百分比；x為γ輻照吸收劑量，Gy）。L滿足方程y＝－10 156.700＋2 655.337lnx，R2＝0.923（y為DSB的斷裂產額；x為γ輻照吸收劑量，Gy）。

圖3 γ輻照后枯草芽孢桿菌脈沖場電泳圖Fig.3 PFGE electrophoretogram of Bacillus subtilis afterγradiation

圖4 γ輻照誘導的枯草芽孢桿菌DSB水平Fig.4 DSB level of Bacillus subtilis induced byγradiation

3 討論

3.1 輻射滅活細菌營養體和芽孢的效應差異

有研究得到γ輻照滅活枯草芽孢桿菌芽孢樣品的劑量為1.7～2.5kGy［8］；我們也曾得到同樣條件下的γ輻照對枯草芽孢桿菌芽孢樣品的D10為2 700Gy；另外，在考查紫外線的損傷效應時，得到枯草芽孢桿菌營養體和芽孢樣品的D10分別為9.84和47.98J／cm2［3］。這些結果表明，枯草芽孢桿菌的不同存在狀態對電離輻射的耐受性差異很大，芽孢狀態的輻射抗性遠大于營養體。電離輻射的種類、細胞存在狀態、細胞載體、干燥程度等均會影響電離輻射的生物損傷效果［9－10］。

3.2 γ輻照對細菌胞內抗氧化酶活性和DNA的影響

電離輻射的生物損傷效應是電離輻射的直接電離激發、自由基的氧化損傷以及細胞自身修復協同作用的結果。在本研究體系中，由于菌體存在于水溶液中，γ輻照會誘發水產生大量的氧自由基，因此對生物體的傷害以間接作用為主，主要包括自由基等對生物酶活性及對DNA的損傷。SOD是一種清除體內超氧陰離子自由基的金屬酶類，其結合的金屬種類不同，可將SOD 分為3類：Cu／Zn－SOD、Mn－SOD和Fe－SOD。而枯草芽孢桿菌主要含有Mn和Fe－SOD同工酶。枯草芽孢桿菌營養體的SOD活性隨輻照劑量變化的結果顯示，SOD活性與劑量無明顯的相關性，尤其在低劑量輻照下，隨劑量的變化無明顯規律。這可能是因為SOD主要是使超氧陰離子自由基發生歧化反應，生成氧氣和過氧化氫，但它并非生物體清除氧損害的最終酶類，生成的過氧化氫要由體內的過氧化氫酶等來最終清除。過氧化氫作為機體內的信號分子，會刺激其他一些抗氧化酶的表達，同時也會對酶的活性造成損傷。因此，電離輻射對SOD活性的效應受到多種因素調節，各種抗氧化酶之間的相互影響，抗氧化酶體系與自由基之間的動態效應均會影響其活性，因此欲研究電離輻射抗氧化酶的效應，應綜合考慮其他幾種抗氧化酶的活性，進行深入研究。

電離輻射可引起DNA多種形式的改變，DSB是損傷中常見和重要的形式，其中非修復性的DSB被認為是輻照損傷細胞最重要的原發事件。Dahm等［11］認為，隨著輻照劑量的增大，DNA雙鏈斷裂加劇，其修復所需的時間也增長；但細胞修復在照后15h便基本完成，照后24h剩余的DSB即可認為是不可修復的DSB。多數研究者認為非修復性的DSB可能與細胞致死有極其密切的關系。形成不可修復的DSB可能是因為細胞本身的性質和入射粒子的電離特性［12］。自1996年美國Cooper實驗室首先報道了DSB非隨機分布的現象后，國內外相繼發現 DSB非隨機分布現象［13－14］。本研究中，枯草芽孢桿菌DNA雙鏈斷裂水平隨γ射線劑量增大而不斷上升。另外，當劑量為50～800Gy時，細胞DSB明顯增加，同時細胞存活率急劇下降，這進一步驗證DSB與細胞存活率相關。DNA作為遺傳信息的載體，其損傷會導致生物大分子結構功能的改變，雖然DSB可能不是造成生物損傷的唯一途徑，但深入研究輻射對DNA的損傷具有十分重要的意義。

4 結論

γ射線穿透力強、射程遠，劑量較為均勻，具較強的殺菌力，是常用的電離輻射滅菌手段。本研究采用50～2 000Gy的γ射線輻照枯草芽孢桿菌，從細胞水平、蛋白水平、分子水平系統考查了γ輻照對枯草芽孢桿菌營養體的損傷效應。在劑量率為15Gy／min時，得到D10為365Gy，當劑量達800Gy時，滅菌率達99.75%，表明γ輻照對枯草芽孢桿菌營養體有較強的損傷效應。

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