外周血樹突狀細(xì)胞(DCS)疫苗治療婦科惡性腫瘤的臨床及實(shí)驗(yàn)研究

姚 勤

(太康縣康復(fù)醫(yī)院,河南太康461400)

1 材料來源

1.1 臨床資料

2009年8月—2010年6月,對(duì)在我院住院治療的15例患者進(jìn)行DCS疫苗治療。其中卵巢惡性腫瘤10例(轉(zhuǎn)移癌2例)、子宮頸癌5例,均為Ⅱ期以后病例,年齡36～65歲,平均年齡46.8歲。

1.2 主要試劑

rhGM-CSF、白介素4(IL-4)購自深圳晶美生物工程公司,淋巴細(xì)胞分離液購自天津中科院血液病研究所,RPMIl640培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司,新生牛血清自制。

1.3 腫瘤細(xì)胞株

Hela細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞株3AO:本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)傳代。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樹突狀細(xì)胞(DCS)疫苗治療技術(shù)路線

①手術(shù)中取腫瘤組織送實(shí)驗(yàn)室,一部分體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞,另一部制備腫瘤可溶性抗原;②取患者的外周全血10～15mL(肝素防凝)送實(shí)驗(yàn)室,分離DCS,制備疫苗;③一周后,將制備好的疫苗取回,給病人作皮下注射,同時(shí)送第2次用防凝血,分離DCS制備疫苗;④一周后,取回第2次用DCS疫苗,皮下注射,同時(shí)送第 3次用防凝血,分離 DCS制備疫苗;⑤一周后,取回第3次用DCS疫苗,皮下注射。待病人一月后復(fù)查時(shí),抽取防凝血做免疫學(xué)檢測。

2.2 樹突狀細(xì)胞(DCS)疫苗的制備方法

(1)自身可溶性腫瘤抗原的制備:手術(shù)中無菌獲取患者的腫瘤組織,并盡可能避免非腫瘤組織,立即送實(shí)驗(yàn)室,取適量加RPMIl640培養(yǎng)液,低滲反復(fù)凍溶3次,過濾除菌,即為無菌可溶性全抗原。

(2)樹突狀細(xì)胞(DCS)的分離:取患者的外周全血10～15mL(肝素防凝),生理鹽水對(duì)倍稀釋,緩緩加入盛有等量淋巴細(xì)胞分離液的離心管中,3 000～4 000r/min離心25min,用平頭吸管吸取界面灰黃層細(xì)胞,即白細(xì)胞層。加人生理鹽水混勻,5 000r/min離心10min,棄上清,取沉淀,再加生理鹽水混勻,2 000r/min離心10min,洗3次,以含10%患者自身血清的RPMIl640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞,置培養(yǎng)瓶中,37℃、5%CO2培養(yǎng)2h,輕輕反過培養(yǎng)瓶,將上清液中非貼壁細(xì)胞倒入另一培養(yǎng)瓶中,即得貼壁的單核細(xì)胞,補(bǔ)加10%FCS1640,同時(shí)加入hGM-CSF200ng/mL,IL-4 600U/mL,置37℃度、5%CO2培養(yǎng)。非貼壁細(xì)胞同時(shí)培養(yǎng),但不必加入各種細(xì)胞因子。貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至第3～4天,在細(xì)胞因子作用下,即變?yōu)閼腋〉?具有突起的未成熟的DCS。

(3)DCS疫苗的制備:未成熟的DCS具有攝取、加工抗原的能力,加入可溶性腫瘤抗原,繼續(xù)培養(yǎng)至第7天,即得到遞呈抗原能力的成熟樹突狀細(xì)胞疫苗。

(4)疫苗的回輸離心收集DCS疫苗,用生理鹽水反復(fù)洗滌4次,最后溶于1mL生理鹽水中,細(xì)胞含量約為(1～2)×106,皮下接種給患者。

2.3 免疫學(xué)檢測

2.3.1 體外細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)水平檢測

①從制備DCS時(shí)留下的上清液中常規(guī)分離T細(xì)胞;②CTL的制備:于多空板中加入T淋巴細(xì)胞(1×105,作為反應(yīng)細(xì)胞)、DCS疫苗(5×103,作為刺激細(xì)胞)在IL-2(100U/mL)存在的條件下,37℃、5%CO2培養(yǎng)5天,收集 T細(xì)胞(即特異性抗原激活的CTL),以RPMIl640培養(yǎng)液稀釋備用;③腫瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng):將手術(shù)切除的瘤組織無菌剪碎至1mm3,加0.2%胰酶消化30min,離心,棄上清,沉淀以含15%新生牛血清的1 640培養(yǎng)液懸浮吹打,室溫沉淀5min,取上清液,顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105,接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶,5%CO2、37℃靜止培養(yǎng),7天后長成單層,以2%胰酶消化傳代備用。

2.3.2 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果

細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果,見表1。

表1 DCS激活的CTL對(duì)患者自身腫瘤細(xì)胞,HeLa細(xì)胞,卵巢癌細(xì)胞株3AO的殺傷力

表2顯示DCS疫苗誘導(dǎo)的CTL對(duì)患者自身腫瘤細(xì)胞具有明顯的殺傷力,但對(duì)HeLa細(xì)胞,卵巢癌細(xì)胞株3AO僅有微弱的殺傷力,DCS及未激活T細(xì)胞對(duì)患者自身腫瘤細(xì)胞無殺傷作用。

細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn):以DCS激活的CTL作為效應(yīng)-細(xì)胞,患者自身腫瘤細(xì)胞、Hela細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞株3AO作為靶細(xì)胞,效靶比為50∶1進(jìn)行細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)。同時(shí)以DCS及未激活T細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞,患者自身腫瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞,效靶比為50∶1進(jìn)行細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)。用MTI法檢測效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性。

2.3.3 T細(xì)胞亞群變化

分別于DCS疫苗治療前、治療后(一般在第 3次注射后),取肝素防凝的靜脈血2mL,送流式細(xì)胞儀室檢測T細(xì)胞亞群。

3 結(jié)果

疫苗治療后腫瘤控制情況:10例卵巢惡性腫瘤患者,術(shù)后、疫苗治療后均接受常規(guī)化療,其中4例復(fù)發(fā)(1例因減瘤不理想已死亡),5例子宮頸癌患者,1例復(fù)發(fā),但均存活。疫苗治療前、后T細(xì)胞亞群的變化,見表2。

從表2可以看出,患者經(jīng)樹突狀細(xì)胞疫苗治療后,T細(xì)胞亞群發(fā)生明顯變化,CD+4T、CD+8T明顯增加,CD+4/CD+8比例恢復(fù)(P＜0.01)。

表2 治療前后T細(xì)胞亞群變化(s)

表2 治療前后T細(xì)胞亞群變化(s)

分類/項(xiàng)目 CD+3T CD+4T CD+8T CD+4/CD+8治療前 45.51±4.54 24.13±4.2321.89±1.641.08±0.26±治療后 65.05±5.30 42.46±4.47 27.2±1.96 1.60±0.16正常組 59.58±9.94 39.32±6.8424.88±4.98 1.40±0.28

4 討論

DCS作為目前普遍公認(rèn)的抗原遞呈細(xì)胞早就被人們所重視,由于孕婦外周血中該細(xì)胞的含量極少,僅占單核細(xì)胞總數(shù)的0.1%～1.0%,且提取物的分離純化困難,在臨床生化上應(yīng)用不多。近年來,IL-4和GM-CSF等細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用,使體外DCS的擴(kuò)增條件優(yōu)化,為其功能及分化狀態(tài)的進(jìn)一步深入得以基本實(shí)現(xiàn),為卵巢惡性腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。為獲得足夠量的DCS供臨床應(yīng)用,多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都通過分離CD+4的造血干細(xì)胞,并聯(lián)合應(yīng)用多種細(xì)胞少因子的培養(yǎng)體系,獲得功能性DCS,本試驗(yàn)利用外周血分離DC單核細(xì)胞,并選用GM-CSF、IL-4體外誘導(dǎo)DCS,從而獲得了良好的效果。

負(fù)載腫瘤抗原的DCS作為載體后,可以激發(fā)機(jī)體有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答,本試驗(yàn)成功地誘導(dǎo)了具有腫瘤特異性的CTL,與自身腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)后顯示出明顯的抗腫瘤效應(yīng)。充分證明了這一點(diǎn)。從治療后T細(xì)胞亞群的變化上,可以體現(xiàn)DCS在改善機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答中的作用,當(dāng)然,不能排除手術(shù)切除腫瘤或減瘤術(shù)后,由于腫瘤負(fù)荷減輕,機(jī)體的免疫功能本身就得到改善。由于病例數(shù)少,哪一種治療方法起主導(dǎo)作用,還需進(jìn)一步觀察,而且,10例接受DCS治療的卵巢癌患者,其復(fù)發(fā)率也未見明顯降低,所以完善DCS疫苗治療方面,還有大量工作要做。

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