胰島素樣生長(zhǎng)因子-1對(duì)癡呆模型大鼠額葉、海馬Caspase-3 P20活性片段及 Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

石廣濱, 劉 群, 張 昱, 劉洪敏

阿爾茨海默病(AD)是一種神經(jīng)退行性疾病,其病理特征是神經(jīng)原纖維纏結(jié)、老年斑產(chǎn)生和神經(jīng)元丟失。其中細(xì)胞凋亡是神經(jīng)元丟失的重要途徑,并受 caspases家族和 Bcl-2家族調(diào)控。在老年動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,尤其是海馬結(jié)構(gòu)中 IGF-1表達(dá)呈年齡相關(guān)性下降[1],有研究證實(shí)給予 IGF-1抗體的大鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降[2]。因此,認(rèn)為 IGF-1具有改善老齡動(dòng)物學(xué)習(xí)、記憶的能力[3]。研究表明IGF-1可抑制體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[4],IGF-1改善老齡動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力可能與抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)觀察穹隆海馬傘切斷后 caspase-3 P20活性片段及 Bcl-2表達(dá)的變化,并研究 IGF-1對(duì)其影響,探討 IGF-1治療 AD的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠腦立體定位儀(韓國(guó)),Colded CCD圖像采集系統(tǒng)(日本),Image-pro p lus圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)),大鼠特異胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(Peprotech EC公司,英國(guó)),兔抗鼠 Caspase-3 P20多克隆抗體(Santa Cruz公司),生物素化羊抗兔 IgG/Bio(Sigma公司),羊抗鼠 Bcl-2多克隆抗體(Santa Cruz公司),生物素化兔抗羊 IgG/Bio(Sigma公司),DAB顯色劑(天津?yàn)笊锕?,雙刃刀(自制)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與模型建立 Wistar雄性大鼠,鼠齡 3～4個(gè)月,體重 200～250g,全部大鼠在正常溫控、光照及自由攝食條件下飼養(yǎng)。用水迷宮篩選反應(yīng)迅速、活躍的大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、癡呆組、小劑量 IGF-1組、大劑量 IGF-1組,每組 10只大鼠。用 10%水合氯醛 0.33m l/100g腹腔麻醉動(dòng)物;將其固定在大鼠腦立體定位儀上;常規(guī)剪毛、消毒;正中切開(kāi)頭皮,暴露出顱骨。參照大鼠腦立體定位圖譜[5],取前囟后 2.2mm,中線左右各旁開(kāi) 1.0mm處,牙鉆鉆開(kāi)顱骨,切開(kāi)骨膜;用雙刃刀片(寬3.0mm、長(zhǎng)30.0mm)置于上述部位的腦表面,行冠狀切口;然后降刀 4.5mm,外移 1.0mm,再降刀 1.0mm,外移1.5 mm;接著上下提插刀 20次,以保證雙側(cè)海馬傘外側(cè)緣完全切斷;最后抽出刀片,注意無(wú)菌操作,皮膚切開(kāi)處給予少許青霉素粉劑,縫合切口。假手術(shù)組只鉆開(kāi)顱骨,不切斷海馬傘。正常對(duì)照組不給予任何處置。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都給予常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.2 側(cè)腦室給藥方法 參照上述立體定位圖譜,在大鼠腦立體定位儀下取前囟后 0.8mm,中線左旁開(kāi) 1.8mm處,鉆開(kāi)顱骨,垂直埋入剪短的硬膜外導(dǎo)管,深度為硬膜下 3.7mm,去掉導(dǎo)絲回抽見(jiàn)腦脊液后,牙粉固定導(dǎo)管,縫合皮膚。以后給藥時(shí)可拔除導(dǎo)絲,用 10μl微量進(jìn)樣器注射,注射結(jié)束后重新插入導(dǎo)絲,消毒包扎固定。癡呆模型制備 1d后開(kāi)始側(cè)腦室給藥,連續(xù) 21d。小劑量 IGF-1組給予IGF-1 10μl(0.2μg/μl),大劑量 IGF-1組給予 IGF-1 10μl(0.5μg/μl),癡呆組和假手術(shù)組則同時(shí)間給予生理鹽水 10μl。注射時(shí)間大約為 10min,注射完后停留 2min再迅速拔針。正常對(duì)照組不給予任何處置。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,注射亞甲藍(lán)溶液 2μl證實(shí)注射部位確實(shí)在側(cè)腦室。

1.2.3 標(biāo)本制作及觀察 給藥 21d后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行如下處置：4%多聚甲醛灌注取腦,制成蠟塊,每只鼠在靶區(qū)附近連續(xù)切片,片厚 4～5μm,分別行 Bcl-2、caspase-3免疫組化染色;切片脫蠟后經(jīng)30g/L H2O2處理,正常羊血清封閉后,分別滴加羊抗鼠 Bcl-2、兔抗鼠 caspase-3,按 SABC法操作然后應(yīng)用電子計(jì)算機(jī)數(shù)字圖像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 IGF-1對(duì)癡呆模型大鼠額葉、海馬caspase-3 P20活性片段的影響 (1)正常對(duì)照組和假手術(shù)組額葉、海馬 caspase-3 P20陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)很少,陽(yáng)性反應(yīng)弱(見(jiàn)表1、表2);(2)穹隆海馬傘切斷術(shù)后 3d,大鼠額葉、海馬均可見(jiàn) caspase-3 P20陽(yáng)性神經(jīng)元明顯增多,呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),14d后 caspase-3 P20陽(yáng)性神經(jīng)元開(kāi)始減少,但 21d時(shí)額葉、海馬神經(jīng)元中 caspase-3 P20仍有一定表達(dá)(見(jiàn)表1、表2),多數(shù) caspase-3 P20陽(yáng)性神經(jīng)元胞膜、胞質(zhì)著色較深,部分神經(jīng)元胞核著色,呈棕色或棕黃色,多伴胞體萎縮,說(shuō)明穹隆海馬切斷后啟動(dòng)了凋亡機(jī)制;(3)小劑量 IGF-1組和大劑量 IGF-1組與癡呆組相比,細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)顯著減弱,IOD值明顯降低,具有顯著差異(P＜0.001)(見(jiàn)表1、表2),說(shuō)明 IGF-1能夠抑制caspase-3 P20活性片段的表達(dá),減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生;(4)小劑量 IGF-1組與大劑量 IGF-1組比較,Caspase-3 P20陽(yáng)性神經(jīng)元 IOD值明顯降低,具有顯著性差異(P＜0.05或 P＜0.01)(見(jiàn)表1、表2),說(shuō)明小劑量 IGF-1對(duì)caspase-3 P20的抑制作用較大劑量 IGF-1更顯著。

2.2 IGF-1對(duì)癡呆模型大鼠額葉、海馬 Bcl-2蛋白表達(dá)的影響 (1)正常對(duì)照組和假手術(shù)組額葉、海馬 Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)很少(表3、表4);(2)癡呆組額葉、海馬 Bcl-2蛋白在術(shù)后 3d表達(dá)量最高,持續(xù)到 14d,21d陽(yáng)性神經(jīng)元免疫反應(yīng)強(qiáng)度下降(見(jiàn)表3、表4),Bcl-2陽(yáng)性神經(jīng)元胞漿呈棕黃色,部分神經(jīng)元胞核著色;(3)小劑量 IGF-1組和大劑量 IGF-1組與癡呆組相比,額葉、海馬 Bcl-2陽(yáng)性神經(jīng)元明顯增多,著色變深,IOD值明顯增加,具有顯著差異(P＜0.001)(見(jiàn)表3、表4);(4)小劑量 IGF-1組與大劑量 IGF-1組比較,Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞增多,IOD值明顯增高,差異顯著 (P＜0.05或 P＜0.01)(見(jiàn)表3、表4),說(shuō)明小劑量 IGF-1能夠更加顯著的促進(jìn) Bcl-2蛋白的表達(dá)。

表1 各組大鼠額葉caspase-3 P20陽(yáng)性細(xì)胞光密度值(±s,n=10)(×106)

表1 各組大鼠額葉caspase-3 P20陽(yáng)性細(xì)胞光密度值(±s,n=10)(×106)

與癡呆組相比*P＜0.001;與小劑量 IGF-1組相比△P＜0.01,#P＜0.05

組別 3d 7d 14d 21d正常對(duì)照組假手術(shù)組癡呆組小劑量 IGF-1組大劑量 IGF-1組0.18±0.07 0.22±0.06 7.56±0.39 4.61±0.27*5.01±0.36*#0.23±0.03 0.20±0.04 7.73±0.49 3.87±0.25*4.25±0.37*#0.24±0.06 0.23±0.05 6.45±0.57 3.37±0.32*4.16±0.57*△0.21±0.05 0.19±0.08 5.36±0.21 2.13±0.16*3.97±0.12*△

表2 各組大鼠海馬caspase-3 P20陽(yáng)性細(xì)胞光密度值(±s,n=10)(×106)

表2 各組大鼠海馬caspase-3 P20陽(yáng)性細(xì)胞光密度值(±s,n=10)(×106)

與癡呆組相比*P＜0.001;與小劑量 IGF-1組相比△P＜0.01,#P＜0.05

組別 3d 7d 14d 21d正常對(duì)照組假手術(shù)組癡呆組小劑量 IGF-1組大劑量 IGF-1組0.19±0.02 0.18±0.03 8.43±0.72 4.52±0.45*5.12±0.57*#0.21±0.05 0.16±0.06 7.67±0.78 3.36±0.16*4.05±0.76*#0.18±0.06 0.17±0.05 7.89±0.12 4.39±0.46*5.11±0.68*#0.20±0.05 0.19±0.04 5.39±0.32 1.67±0.15*3.89±0.27*△

表3 各組大鼠額葉Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞光密度值(±s,n=10)(×106)

表3 各組大鼠額葉Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞光密度值(±s,n=10)(×106)

與癡呆組相比*P＜0.001;與小劑量 IGF-1組相比△P＜0.01,#P＜0.05

組別 3d 7d 14d 21d正常對(duì)照組假手術(shù)組癡呆組小劑量 IGF-1組大劑量 IGF-1組0.71±0.21 0.70±0.25 5.26±1.17 9.97±2.13*8.37±1.29*△0.68±0.17 0.72±0.31 4.97±1.25 9.36±2.53*7.26±1.27*#0.73±0.24 0.69±0.22 4.22±1.31 8.49±1.77*6.37±1.35*△0.74±0.29 0.73±0.26 3.09±1.02 7.21±1.23*5.86±1.38*#

表4 各組大鼠海馬Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞光密度值(±s,n=10)(×106)

表4 各組大鼠海馬Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞光密度值(±s,n=10)(×106)

與癡呆組相比*P＜0.001;與小劑量 IGF-1組相比△P＜0.01,#P＜0.05

組別 3d 7d 14d 21d正常對(duì)照組假手術(shù)組癡呆組小劑量 IGF-1組大劑量 IGF-1組0.89±0.12 0.91±0.23 5.67±1.32 11.98±2.15*9.56±2.46*#0.88±0.24 0.86±0.31 4.36±1.21 10.25±1.47*8.37±1.32*△0.90±0.21 0.87±0.23 4.03±1.16 8.76±1.56*6.24±1.28*△0.92±0.35 0.89±0.26 3.25±1.12 6.89±1.25*5.16±1.52*#

3 討 論

細(xì)胞凋亡是 AD神經(jīng)元丟失及其它病理學(xué)特征形成的主要原因。Smale等[6]研究發(fā)現(xiàn),AD患者腦內(nèi)海馬區(qū)細(xì)胞凋亡明顯增加,而正常腦內(nèi)幾乎沒(méi)有或很少有細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞根據(jù)所處環(huán)境條件不同和啟動(dòng)細(xì)胞凋亡刺激不同,通過(guò)不同的途徑發(fā)生凋亡,如死亡受體轉(zhuǎn)接蛋白途徑、線粒體-細(xì)胞色素 C途徑,caspases家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著非常重要作用,無(wú)論通過(guò)哪種途徑,caspase-3都是凋亡的執(zhí)行者。Shimohama觀察到,AD患者大腦中 caspase-3蛋白水平較正常對(duì)照組明顯增加[7],在細(xì)胞培養(yǎng)中,caspase-3可被 Aβ25-35、活性氧 (ROS)及鈣穩(wěn)態(tài)的失衡而激活[8]。在低濃度時(shí),三羥基異黃酮 (genistein)能通過(guò)活化雌激素受體(ER),有效地抑制 thapsigargin(內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Ca2+-ATP酶抑制物)誘導(dǎo)的 caspase-3激活,阻止細(xì)胞凋亡[9]。隨著對(duì)細(xì)胞凋亡的深入研究,目前很多學(xué)者認(rèn)為 caspases的激活是細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)的標(biāo)志[10],因此對(duì)這一激活步驟的阻斷是藥物發(fā)揮保護(hù)作用的關(guān)鍵機(jī)制之一。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)正常大鼠額葉、海馬有少量caspase-3 P20弱陽(yáng)性細(xì)胞分布,癡呆組術(shù)后 3d大鼠額葉、海馬均可見(jiàn) caspase-3 P20陽(yáng)性神經(jīng)元明顯增多,呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),14d后 caspase-3 P20陽(yáng)性神經(jīng)元開(kāi)始減少,但 21d時(shí)神經(jīng)元中 caspase-3 P20仍有一定表達(dá),說(shuō)明穹隆海馬傘切斷術(shù)可以觸發(fā) caspase-3調(diào)亡途徑,引起細(xì)胞凋亡發(fā)生。IGF-1小劑量組和IGF-1大劑量組與癡呆組比較,caspase-3 P20陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量顯著減少,細(xì)胞著色變淺,提示 IGF-1能夠通過(guò)抑制 caspase-3活化,進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)額葉、海馬內(nèi)神經(jīng)元存活。

B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphone/leukemia-2,Bcl-2)蛋白可抑制 caspase-3裂解活化。發(fā)揮其抑制凋亡的作用。也有研究證實(shí) Bcl-2作用于神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程,具有抑制細(xì)胞凋亡及類神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)的作用[11]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常大鼠海馬 Bcl-2蛋白表達(dá)較少,癡呆組大鼠 Bcl-2蛋白表達(dá)反應(yīng)性增多,IGF-1小劑量組和 IGF-1大劑量組與癡呆組比較,大鼠額葉、海馬 Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加,同時(shí) caspase-3 P20活性片段表達(dá)較少,差異顯著,提示 IGF-1通過(guò)增強(qiáng) Bcl-2蛋白表達(dá),減少 caspase-3的裂解活化,抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)額葉、海馬內(nèi)神經(jīng)元存活及損傷修復(fù)。IGF-1引起 Bcl-2基因表達(dá)改變的作用機(jī)制尚不完全清楚。

有研究認(rèn)為 IGF-1能激活細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB),調(diào)節(jié) Bcl-2啟動(dòng)子,因此可能在轉(zhuǎn)錄水平提高 Bcl-2表達(dá)[12]。也有研究認(rèn)為 IGF-1可以通過(guò) PI3-Kinase/Akt途徑改變Bcl-2的表達(dá),抑制 NO誘導(dǎo)的原代海馬神經(jīng)元凋亡[13]。

本研究結(jié)果證實(shí),小劑量 IGF-1比大劑量 IGF-1能更有效地抑制 caspase-3 P20表達(dá),并促進(jìn) Bcl-2表達(dá),由此,本研究推測(cè) IGF-1發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用存在著一個(gè)最佳劑量,但最佳劑量尚需今后做大量研究工作來(lái)確定。

本研究表明 IGF-1能夠通過(guò)抑制 caspase-3的裂解活化,促進(jìn) Bcl-2的表達(dá),減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。因此,IGF-1有可能成為 AD治療的神經(jīng)保護(hù)性藥物之一。

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