白血病G6PD蛋白表達的研究

蔣 劍，李永萍，潘 云，李正金，王紅霞

（大理學院附屬醫(yī)院，云南大理 671000）

白血病G6PD蛋白表達的研究

蔣 劍，李永萍*，潘 云，李正金，王紅霞

（大理學院附屬醫(yī)院，云南大理 671000）

目的：觀察白血病患者骨髓中白血病細胞葡萄糖-6磷酸脫氫酶（G6PD）蛋白的表達情況，探討G6PD與白血病的關系。方法：應用免疫組化方法檢測35例白血病患者和35例非惡性血液病患者骨髓組織標本中白血病細胞G6PD蛋白的表達，比較白血病患者和非惡性血液病患者G6PD蛋白表達率的差異。結果：G6PD蛋白在白血病骨髓組織白血病細胞中呈現弱陽性表達。35例白血病患者骨髓組織中G6PD蛋白陽性表達率為25.7% （9/35），而35例非惡性血液病患者骨髓組織中G6PD蛋白陽性表達率為2.9%（1/35），差異有統計學意義（P<0.05）。結論：白血病可能存在G6PD蛋白的表達上調，值得進一步研究。

G6PD蛋白；白血病；免疫組化

白血病(leukemia)是造血干細胞的惡性克隆增生性疾病。我國的發(fā)病率約為2.76/10萬，在兒童及35歲以下成人的惡性腫瘤中居第1位。葡萄糖6-磷酸脫氫酶 (glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD，EC1.1.1.49)存在于所有組織和細胞中，G6PD由G6PD基因編碼，G6PD基因是典型的看家基因，定位于染色體Xq28。在人類由于G6PD基因突變，酶活性降低所引起的紅細胞G6PD缺乏癥是一組累及全球4億人的遺傳性溶血性疾病。

G6PD是腫瘤研究的熱點之一。國內李瑞巖等〔1〕發(fā)現G6PD蛋白在膠質瘤中的表達上調，且與膠質瘤病理分級相關。G6PD也被認為是一個很好的治療靶點。Kuo等〔2〕將G6PD高表達的NIH 3T3細胞注射到裸鼠皮下可快速誘導裸鼠產生腫瘤，而且腫瘤的大小與G6PD活性高低相關。并觀察到谷胱甘肽（glutathione，GSH）合成抑制劑—丁硫氨酸亞礬胺（Buthionine-S-R-sulfoximine，BSO）能抑制高表達G6PD的NIH 3T3細胞集落形成率。朱月春等〔3〕構建的G6PD缺陷型人皮膚黑色素瘤A375的穩(wěn)轉細胞，G6PD活性明顯降低，盡管可以存活，但其生長速度明顯減慢，單細胞克隆形成能力降低，凋亡細胞數增加。提示G6PD缺陷可明顯抑制腫瘤細胞的生長和增殖。伊馬替尼極具臨床應用前景的原因之一是其除了能抑制BCR-ABL基因的激活，還能降低白血病細胞G6PD的活性，從而抑制白血病細胞生長〔4-5〕。由上可見，G6PD與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療均有關系，抑制G6PD的活性能夠有效抑制腫瘤細胞的生長。

大量研究表明：白血病患者外周血中紅細胞G6PD活性也存在改變〔6-8〕，但白血病細胞中G6PD蛋白表達的研究卻少見報道，為了探明白血病細胞G6PD蛋白的表達，以期為白血病的診斷、治療和預后提供實驗依據，應用免疫組化的方法檢測了35例白血病患者的骨髓組織中白血病細胞的G6PD蛋白，現將研究結果報告如下。

1 資料和方法

1.1 研究對象 收集我院病理科2008年4月至2010年10月共70例存檔骨髓活檢組織蠟塊，病例組35例經臨床診斷和骨髓病理活檢確診為白血病,按FAB分型標準分為：急性髓細胞白血病AML-M1型3例，AML-M2型6例，AML-M3型5例，AML-M4型1例，AML-M5型1例，AML-未分型1例，急性混合細胞白血病1例，急性淋巴細胞白血病5例，慢性粒細胞性白血病9例，慢性淋巴細胞白血病3例。其中男性22例，女性13例，年齡12～82歲，中位年齡46歲。對照組35例為臨床診斷和骨髓病理活檢均證實為非惡性血液病患者，其中男性19例，女性16例，年齡10～73歲，中位年齡49歲。

1.2 主要試劑和方法

1.2.1 主要試劑 兔抗人G6PD多克隆抗體（購于武漢博士德公司）；PV-9000通用型二步法免疫組化檢測試劑盒（購于北京中杉金橋生物技術有限公司）；DAB顯色劑（購于福州邁新公司）。

1.2.2 方法 標本均為10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)4μm切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，高壓鍋熱修復抗原。3%H2O2室溫避光孵育10 min，以消除內源性過氧化物酶的活性；分別滴加適當的兔抗人G6PD多克隆抗體，37℃孵育2 h；滴加聚合酶輔助劑，37℃孵育20min，滴加辣根酶標記羊抗兔多聚體試劑，37℃孵育20min。以上每步均用PBS沖洗3 min，3次；加DAB顯色劑顯色；自來水充分沖洗、蘇木精襯染、脫水透明、中性樹脂封片，鏡下觀察。本實驗均用已知陽性片作為陽性對照，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.3 結果判定標準 免疫組化結果進行半定量分析。細胞質著色呈棕黃色為陽性表達，陽性細胞率＜10%記為陰性；陽性細胞10%~25%為+；陽性細胞25%~50%為++；陽性細胞>50%為+++。

1.4 統計學分析 所有資料經SPSS11.5統計軟件包進行χ2檢驗。

2 結果

白血病細胞中G6PD的表達用免疫組化檢測到35例白血病患者骨髓組織標本中有9例呈陽性表達，陽性率為25.7%，35例對照組骨髓組織標本僅有1例G6PD呈陽性表達，陽性率為2.9%；差異有統計學意義（P=0.006）。見表1，圖1、2。所有G6PD的表達都為弱陽性。

表1 G6PD蛋白在白血病細胞中的表達

圖1 增生性貧血G6PD表達陰性（免疫組化，×400）

圖2 急性早幼粒細胞白血病G6PD表達弱陽性（免疫組化，×400）

3 討論

G6PD是磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）的限速酶，其活性決定6-磷酸葡萄糖進入磷酸戊糖途徑的流量。該酶主要受NADPH/NADP+比例的影響，其比例升高，磷酸戊糖旁路被抑制，比例降低時則被激活。磷酸戊糖途徑為生物體提供還原型輔酶Ⅱ（reduced form of nicotinamideadenine dinucleotide phosphate，NADPH）和5-磷酸核糖（ribose-5-phosphate，R-5-P）。其中NADPH是生物體內主要還原物質之一，廣泛參與細胞內信號轉導、抗氧化應激等，而5磷酸核糖是細胞增殖過程中合成核苷酸不可缺少的原料，是腫瘤細胞快速增殖的需要。

1975年Bovin〔6〕最早報道白血病患者紅細胞G6PD的活性減低，在25例AML中有2例G6PD活性減低，同時發(fā)現9例兒童AML的G6PD活性均增高。錢鏡秋等〔7〕觀察了G6PD活性與病情關系，凡酶活性增高或雖不增高甚或降低但能恢復正常者，均易獲得緩解，反之酶活性降低而又不能恢復者則不易獲緩解。張學軍等〔8〕的研究則顯示AML活動期G6PD活性較正常明顯降低，緩解期無明顯恢復；ALL各期均無顯著變化。但是Sharma等〔9〕在67例白血病患者中并沒有發(fā)現紅細胞G6PD的活性發(fā)生改變。以上研究可能提示了白血病紅細胞的G6PD活性改變規(guī)律：AML的G6PD活性以降低為主，ALL以增高為主，且大多發(fā)生在初治或復發(fā)階段，在緩解階段G6PD活性可恢復正常。

本研究發(fā)現白血病細胞中G6PD蛋白呈陽性表達（9/35），而對照組中僅有1例感染性疾病患者骨髓細胞G6PD蛋白呈陽性表達，提示白血病細胞中G6PD蛋白的表達上調。Batetta等〔10〕研究顯示：不管是G6PD缺乏還是G6PD正常的白血病細胞，與外周血單核細胞相比，其G6PD活性均明顯增高。G6PD缺乏的白血病患者與G6PD正常的白血病患者相比G6PD基因呈高水平表達。白血病細胞中G6PD蛋白表達上調的具體機制尚不清楚，可能為〔10-11〕：①白血病細胞快速增殖過程中需要增加G6PD蛋白的表達，從而使進入磷酸戊糖途徑進行代謝的葡萄糖增加，使白血病細胞能利用代謝中間體合成ATP和某些底物進行大分子的合成；②白血病細胞通過增加G6PD蛋白表達來上調磷酸戊糖途徑以增強抗氧化能力，從而更利于細胞存活。

本文承蒙大理學院附屬醫(yī)院病理科畢磊等老師提供實驗技術指導，謹此致謝！

〔1〕李瑞巖，蔣傳路.腦膠質瘤中G6PD蛋白的表達及與腫瘤分級的相關性〔J〕.哈爾濱醫(yī)科大學學報,2008,42（5）:497-499.

〔2〕KuoW Y,Lin JY,Tang TK.Human glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PD)gene transforms NIH 3T3 cells and induces tumors in nudemice〔J〕.Int JCancer,2000,85（6）:857-864.

〔3〕朱月春,呂會茹,李丹怡,等.siRNA沉默G6PD表達對人皮膚黑色素瘤細胞生長及凋亡的影響〔J〕.生物化學與生物物理進展,2008,35(3):327-334.

〔4〕Boren J,Marta C,Silvia M,eta1.Gleevec（STI571）influencesmetabolic enzyme activities and glucose carbon flow toward nucleic acid and fatty acid synthesis inmyeloid tumor cells〔J〕.JBiol Chem,2001,276（41）:37747-37753.

〔5〕Gottschalk S,Anderson N,Haim C,eta1.Imatinib（STl571）-mediated changes in glucose metabolism in human leukemia BCR-ABL-positive cells〔J〕.Clin Cancer Res,2004,10（4）:6661-6668.

〔6〕Boivin P,Galand C,Hakim J,et al.Acquired erythroenzymopathies in blood disorders:study of 200 cases〔J〕.Br JHaematol,1975,31（4）:531-543.

〔7〕錢鏡秋,吳月芳,徐杰.小兒白血病紅細胞PK、G6PD活性測定的臨床意義〔J〕.臨床兒科雜志,1991,9（4）:213-214.

〔8〕張學軍,徐世榮,姚爾固,等.急性白血病患者紅細胞丙酮酸激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性改變〔J〕.中華血液學雜志,1995,16（6）:316-317.

〔9〕Sharma S,PatiHP.Erythrocyte enzyme abnormalities in leukemias〔J〕.JAssoc Physicians India，2006,54:453-457.

〔10〕Batetta B,PulisciD,Bonatesta RR,etal.G6PD activity and gene expression in leukemic cells from G6PD-deficientsubjects〔J〕.Cancer Lett，1999,140（1/2）:53-58.

〔11〕邱嘉斌,何玲.基于瓦博格效應的腫瘤治療新策略〔J〕.藥學進展,2009,33（9）:385-395.

（責任編輯 張 煥）

Expression of G6PD P rotein in L eukem ia

JIANG Jian,LIYongping*,PAN Yun,LIZhengjin,WANG Hongxia
（Affiliated Hospital of DaliUniversity,Dali,Yunnan 671000，China）

Objective:To investigate the expression of G6PD protein in human leukemia and analyze the relationship between G6PD and leukemia.MethodsImmunohistochemical method was applied to detect the expression of G6PD protein in the bone marrow tissue of 35 leukemia patients and 35 cases of non-hematologic malignancies.Non-hematologic malignancies were used as control group.The comparison of G6PD protein rate in leukemia patents and the controlwas studied.ResultsThe positive expression rate of G6PD protein was 25.7%（9/35）in leukemia patients and 2.9%（1/35）in control.Data showed a statistically significant difference in G6PD expression between the two groups （P<0.05）.ConclusionG6PD protein was high expressed in leukemia,which needed further study.

G6PD protein;leukemia;immunohistochemistry

R733.7

A

1672-2345（2011）02-0027-03

2011-01-02

蔣劍，2008級碩士研究生，主要從事血液病基礎與臨床研究.

*通信作者：李永萍，教授，電話：0872-2253090