甘蔗渣纖維素降解菌的篩選及鑒定

賀軍軍，羅萍，陳永輝，易潤華，李勤奮，戴小紅

(1.中國熱帶農業科學院湛江實驗站，廣東湛江524013;2.廣東海洋大學，廣東湛江524088; 3.中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所，海南儋州571737)

甘蔗渣纖維素降解菌的篩選及鑒定

賀軍軍1，羅萍1，陳永輝1，易潤華2，李勤奮3*，戴小紅1

(1.中國熱帶農業科學院湛江實驗站，廣東湛江524013;2.廣東海洋大學，廣東湛江524088; 3.中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所，海南儋州571737)

通過利用多種選擇性培養基，從自然發酵不同階段的甘蔗渣中分離到多種纖維素分解菌，經過初篩和復篩，獲得了降解纖維素的功能菌株c1g3-3及其最適功能培養基蛋白胨纖維素培養基(PCS)，并通過形態、生理生化和分子綜合鑒定得出c1g3-3鑒定為木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)。

甘蔗渣;纖維素;功能降解菌

甘蔗是我國大宗的糖料經濟作物，在我國熱區的經濟中占有重要地位，是廣西和云南的主要產業。甘蔗渣是甘蔗榨糖后的主要副產品，屬于農業固體廢棄物，主要組分:干物質90%～92%，粗蛋白質2.0%，粗纖維44%～46%，粗脂肪0.7%，無氮浸出物42%，粗灰分2%～3%［1］，如果不加以處理或利用會造成環境污染和資源浪費。因此，甘蔗渣的利用一直受到重視［2-8］。近幾年，隨著生物有機肥的快速發展，甘蔗渣成為生物有機肥堆制原料而受到重視，并配置成有機肥在農業上得到應用［9］。然而，由于甘蔗渣中纖維素、半纖維素和木質素含量高(占90%以上)，降解速度慢、堆肥時間長，造成嚴重環境污染，成為肥料化利用的制約因素和研究重點。本文從甘蔗渣資源化利用的角度出發，通過對多種分離源的微生物進行分離、純化和篩選，得到了快速降解甘蔗渣纖維素功能降解菌株，并對其生理特性及其培養條件進行探討，以期為工廠化應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 分離材料采集用于分離的甘蔗渣采自廣東省豐收糖業發展有限公司堆積場中。

1.1.2 供試分離和篩選培養基①樣品分離采用4種培養基，具體如下:赫奇遜CMC培養基(C1):NaCl 0.1 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeCl30.01 g，CaCl20.1 g，NaNO32.5 g，CMC 10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4;赫奇遜CMC-Na培養基(C2):NaCl 0.1 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeCl30.01 g，CaCl20.1 g，NaNO32.5 g，CMC-Na 10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4;纖維素剛果紅平板培養基(C3): (NH4)2SO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41 g，NaCl 0.5 g，CMC-Na 10 g，瓊脂20 g，剛果紅0.2 g，蒸餾水1 L，pH值自然;纖維素剛果紅平板培養基(C4):(NH4)2SO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41 g，NaCl 0.5 g，CMC 10 g，瓊脂20 g，剛果紅0.2 g，蒸餾水1 L，pH值自然;②功能菌株篩選培養基，具體如下:Dubos纖維素培養基: NaNO30.5 g，K2HPO41 g，Fe2(SO4)3·7H2O 0.001 g，CMC 5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，蒸餾水1 L，pH 7.5;Hutchison培養基:NaNO32.5 g，NaCl 0.1 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeCl30.01 g，CaCl20.1 g，CMC 5 g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4;磷酸銨鈉培養基:Na(NH4)HPO42 g，CaCO35 g，KH2PO41 g，CaCl2·6H2O 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨1 g，蒸餾水1 L，纖維素5 g;蛋白胨纖維素培養基:NaCl 5 g，CaCO32 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，剛果紅0.1 g，蛋白胨5 g、酵母膏5 g，纖維素5 g，微量元素溶液0.5 mL(微量元素液成分(g/L):ZnSO40.30，CaCl20.25，CuSO40.25，FeSO40.20)，蒸餾水1 L，50℃靜置培養;改良纖維素剛果紅培養基(g/L):NaCl 0.5，(NH4)2SO42，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO41，纖維素粉5，蛋白胨1，蒸餾水1 L，pH值自然; CMC培養基:(NH4)2SO44 g，KH2PO42 g，CMCNa 5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蛋白胨1 g，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.4。

1.2 方法

1.2.1 纖維素降解菌的分離采用平板稀釋法進行分離。稱取甘蔗渣樣品1.00 g，加入無菌水10 mL，在振蕩機上振蕩10 min，形成懸液，吸取1 mL懸液依10倍法稀釋到10－6，取10－6稀釋液0.1 mL涂布于分離培養基中，每處理重復3次，28℃培養72～96 h，計算菌落數。根據菌落形態、顏色等挑取單菌落，按常規方法純化后保存。

1.2.2 纖維素功能降解菌的篩選菌株初篩采用濾紙分解法，將濾紙剪成小條，放入試管中，使其略露出液面。將各菌株接種到以濾紙為唯一碳源的Dubos液體培養基中，然后于30℃、110 r/ min振蕩培養5 d，觀察濾紙的崩解效果;在初篩的基礎上，以FPA酶(3.5-乙硝基水楊酸比色法測定)為評價指標進一步篩選得出纖維素功能降解菌株。

1.2.3 培養基篩選將篩選得到的功能菌株分別接種到菌株篩選培養基中，進行功能培養基的篩選，每個處理3個重復。

1.2.4 菌株鑒定對篩選出的纖維素降解菌進行種的鑒定:①形態學特征鑒定:將篩選出的纖維素降解菌接種于PDA平板中，28℃恒溫培養2～3 d，觀察其菌落的生長情況、外觀形態;②生理生化特征:主要包括過氧化氫酶、苯丙氨酸脫氨酶、卵磷脂酶試驗，糖、醇類分解試驗，V-P測定，明膠液化，淀粉水解，丙二酸利用，吲哚產生及生長pH值和溫度的測定等，方法參考東秀珠《常見細菌系統鑒定手冊》［10］;③分子鑒定:細菌的16S rRNA分析:經改良的SDS法提取菌株降解微生物的基因組DNA。PCR引物為細菌鑒定通用引物:16(+)5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3，16(－)5-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CT-3。25 μL擴增體系:模板2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，10×buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mmol/L) 2.5 μL，DNTP(2 mmol/L)2.5 μL，Taq(3 U/μL) 0.35 μL，ddH2O 13.15 μL。

將提取的基因組DNA作為模板進行PCR擴增。反應程序:94℃預變性4 min，94℃變性1 min，50℃復性30 s，72℃延伸30 s，進行35個循環，72℃延伸10 min。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳標準條件下檢測，回收目標DNA片段，由生工生物工程(上海)有限公司完成測序，測序結果用BLAST軟件在GenBank進行同源性比較，以Clustal X進行多序列比對后，用MEGA4.0的Neighbor-Joining法構建系統發育樹，并進行1000次Bootstraps檢驗。

2 結果與分析

2.1 功能菌株分離

由表1可見，培養基C1最適合分離纖維素降解菌，在樣品稀釋到10－6時，每個平板可以得到菌落數5.20 cfu/g;其次是C3和C2分離效果較好，分離菌落數分別為3.20和2.80 cfu/g;而C4的分離效果較差。

表1 不同培養基纖維素降解菌株分離效果(單位:cfu/g)Table 1Effect of cellulose degradation strains in different mediums(Unit:cfu/g)

2.2 功能菌株初篩

采用濾紙分解法對纖維素降解菌進行初篩，由表2可見，從甘蔗渣中共分離出27個菌株，其中降解能力強的有5個菌株，中度降解能力的有5個菌株，輕微降解能力的有13個菌株及沒有任何降解能力的4個菌株。

表2 纖維素降解功能菌株初篩Table 2First screening of cellulose degrading-bacteria

2.3 功能菌株復篩

濾紙中的纖維素含量較高，FPA酶水解濾紙中的纖維素，釋放出的還原糖與3，5-乙硝基水楊酸(DNS)反應，產生顏色變化，這種顏色變化與釋放的還原糖量成正比關系，即與酶樣品的酶活性成正比關系。通過對FPA酶活性來評價初篩菌株對纖維素降解能力的大小，從而確定纖維素降解高效菌株。通過實驗表明:c1g3-3菌株的FPA酶活性最好，為4.83 μg/(mL·h)，被確定為纖維素功能降解菌株(表3)。

表3 纖維素降解功能菌株復篩(單位:μg/(mL·h))Table 3Second screening of cellulose degrading-bacteria (Unit:μg/(mL·h))

2.4 功能培養基篩選

利用功能菌株在不同培養基上的FPA酶活性來評價菌株功能發揮的最適培養基。由表4可知:c1g3-3 FPA酶活性在6種不同培養基表現不一，在蛋白胨纖維素培養基(PCS)上活性最高為54.85 μg/(mL·h)。因此，c1g3-3菌株最適功能培養基為蛋白胨纖維素培養基(PCS)。

表4 功能菌株在不同培養基上FPA酶活(單位:μg/(mL·h))Table 4FPA enzyme activity of degrading-bacteria in different mediums(Unit:μg/(mLl·h))

2.5 高效菌株鑒定

2.5.1 表面形態特征及生理生化指標c1g3-3菌株菌落顏色黃白色，表面濕潤、光滑，邊緣不整齊;桿菌，革蘭染色顯陰性，周生鞭毛，輕微彎曲的桿狀，大小為0.55 μm×1.58 μm，菌株生理生化測定結果見表5。

表5 c1g3-3菌株的生理生化特征Table 5Physiological and biochemical characteristics of c1g3-3 strain

續表

2.5.2 分子鑒定c1g3-316S rDNA堿基長度為1.5 bp左右，將菌株的16S rDNA全序列輸入GenBank核酸序列數據庫進行比對，發現與無色桿菌屬(Achromobacter xylosoxidans)之間的同源性達到99%。選取近緣的菌株序列通過N-J算法構建系統進化樹(圖1)，將其初步定為木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)。

圖1 c1g3-3菌株16S rDNA序列系統發育樹Fig.1Phytogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of c1g3-3 strain

3 小結與討論

本文以甘蔗渣堆肥所需菌劑的開發為主，通過對多種分離源的纖維素降解菌進行分離、純化和篩選，從甘蔗渣中獲得了2株纖維素降解功能菌，并對其進行了最佳培養基的篩選與鑒定。通過試驗得出以下結論:①利用多種選擇培養基，經過初篩和復篩，從自然發酵不同階段的甘蔗渣中獲得了纖維素功能降解菌株c1g3-3;②c1g3-3菌株最適功能培養基為蛋白胨纖維素培養基(PCS);③通過形態、生理生化和分子綜合鑒定得出c1g3-3鑒定為木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)。

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Screening and Identification of Cellulose Degrading-Bacteria from Fermented Bagasse

HE Jun-jun1，LUO Ping1，CHEN Yong-hui1，YI Run-hua2，LI Qin-fen3，DAI Xiao-hong1
(1.Zhanjiang Res.Sta.，CATAS，Zhanjiang 524013;2.Guangdong Ocean Uni.，Zhanjiang 524088; 3.Inst.of Envir.＆Plant Prot.，CATAS，Danzhou Hainan，571737)

Several cellulose degrading-bacteria were isolated form naturally fermented bagasse at different stages using multiple selective media.Strain c1g3-3，which had the capability of degrading cellulose of bagasse，was obtained through preliminary and secondary screenings，as well as the optimal PCS medium.Strain c1g3-3 was identified as Achromobacter xylosoxidans according to its morphology，physiology，bio-chemical and molecular characteristics.

bagasse;cellulose;functional degrading-bacteria

Q939.97

A

1005－7021(2011)01－0039－04

中央級公益性科研院所基本科研業務費專項(2008hzslJ021，2009hzs1J033)

賀軍軍男，研究實習員。研究方向為資源開發與利用。Tel:0759-2192696，E-mail:hbj46@163.com

*通訊作者。Tel:0759-2192696，E-mail:qinfenli@sina.com

2010-12-15;

2011-01-25