降解木素白腐菌產漆酶的研究進展

傅 愷 付時雨 詹懷宇

(華南理工大學制漿造紙工程國家重點實驗室，廣東廣州，510640)

降解木素白腐菌產漆酶的研究進展

傅 愷 付時雨 詹懷宇

(華南理工大學制漿造紙工程國家重點實驗室，廣東廣州，510640)

綜述了近年來國內外對于白腐菌產漆酶的研究進展，對液體和固體發酵提高漆酶產量的技術和方法進行了討論和評述，并對今后的研究工作提出了展望。

白腐菌;漆酶;液體發酵;固體發酵;有機廢料;發酵罐

隨著環境保護要求的日益嚴格，制漿造紙清潔生產成為研究熱點。在紙漿的漂白過程中引入生物酶，不僅可以減少化學藥品用量，還能降低廢水的污染負荷，如COD、BOD和AOX等。因此，紙漿生物漂白越來越受到國內外造紙界的關注和重視，其中紙漿的半纖維素酶輔助漂白已實現工業化應用，但是半纖維素酶不能直接降解紙漿中的殘余木素，難以從根本上解決殘余木素的脫除問題［1］。于是開發了新型木素降解酶，利用其直接作用和降解紙漿中的殘余木素成為生物漂白領域的迫切需求。

白腐菌分泌的木素降解酶系主要包括木素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶，其中漆酶在紙漿漂白工業中最具應用前景。近幾年，隨著研究的不斷深入，白腐菌漆酶對木素和與木素結構相似的許多環境污染物的降解作用也越來越受到科研工作者的關注，特別是在紙漿生物漂白［2］、工業廢水處理［3］、有機染料脫色［4］和高分子催化合成［5］等方面，表現出了很大的研究價值和應用潛力。

但是白腐菌漆酶在上述領域中的成功應用，目前需要解決的一個關鍵性問題是如何在控制成本的前提下提高漆酶的產量。優化發酵條件以提高白腐菌產酶能力并降低生產和應用成本是一種最基本也是最常用的研究思路。Borras等［6］學者研究了白腐菌Trametes versicolor在麥芽汁半合成培養基中，對酸性染料蘭納灑脫灰脫色過程中的成本控制問題，發現培養基原料的費用占脫色總成本的比例高達95%，而通過優化培養條件，選用低價的無麥芽汁合成培養基，能夠將脫色成本降低96%，并且脫色效果不變。白腐菌漆酶高效生產的另一種思路是尋找合適的載體進行漆酶基因的異源表達［7］，但是由于白腐菌漆酶中糖基的存在能夠促使漆酶蛋白的水解，因此相對于其他一些已實現工業化生產的氧化還原酶來說——如通過絲狀真菌的基因重組生產葡萄糖氧化酶——白腐菌漆酶在活性宿主上的異源高效表達還較為困難［8］，總體上還處于探索階段，難以滿足漆酶工業化生產和應用的要求。因此目前關于漆酶生產的研究主要還是集中于優化白腐菌的發酵條件上。本文重點介紹了近年來國內外對于白腐菌產漆酶的研究進展，對提高漆酶產量的技術和方法進行了討論和評述。

1 白腐菌產漆酶的培養方法

微生物產酶的發酵過程與菌體周圍的環境因素關系密切，不同的發酵方法對白腐菌分泌漆酶有很大影響，見表1［3-4，9-36］，按照培養方式的不同可將其分為液體培養和固體培養兩大類。

1.1 液體培養

液體培養是指菌絲體在含有一定營養成分的液體培養基中生長和產酶的過程，由于這種方式便于工業化生產和應用，因此，目前對于液體培養白腐菌產漆酶的研究報道較多。其中大部分研究都表明，在液體培養基中添加適量的誘導劑或Cu2+，對白腐菌分泌漆酶具有較為顯著的促進作用。

表1 不同菌種、培養方法和測定底物對漆酶活力的影響

誘導劑的作用機理是它能夠與某些阻遏酶蛋白合成的物質結合，使其發生變構效應，降低這些物質對酶蛋白合成的阻遏作用，啟動結構基因轉錄、翻譯以生成相應的酶蛋白［37］。白腐菌漆酶的誘導劑大多為一些與木素結構類似的低分子芳香化合物或木素降解后的碎片化合物，通常也是漆酶的作用底物，如黎蘆醇、愈創木酚、2，2-連氮-二 (3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)、二甲苯胺、阿魏酸、丁香醛、單寧酸、香草酸、香豆酸等。它們在結構上的共同特征是芳環上通常連有—OH或—NH2基團。吳香波等［31］報道白腐菌Coriolus versicolor在液體培養時，添加0．5～1 mmol/L ABTS可將漆酶產量提高5倍，漆酶活力高達230 IU/mL。Madhavi等學者［18］的研究也發現，多種芳香族誘導劑對一株野生型白腐菌WR-1分泌漆酶都具有促進作用，其中0．8 mmol/L二甲苯胺的誘導效果最為明顯，發酵液中漆酶最高活力可達692 IU/mL。一般來講，不同的誘導劑對同一株白腐菌產酶的影響往往不同，而不同的菌株通常具有不同的最適宜誘導劑。

此外，金屬元素，如銅、錳、鐵、鋅等，往往或是酶蛋白活性基團的組成部分，或是酶的激活劑，對酶活力的影響也不容忽視。許多研究都證實［15，19，23，32，35］，在培養基中添加一定量的 Cu2+離子，對多種白腐菌分泌漆酶都具有顯著的促進作用。Kurtz等［38］對此提出的解釋為：白腐菌漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，每個酶蛋白分子中一般都含有4個Cu2+，可能是由于相關基因轉錄合成漆酶時需要元素銅，因此在限銅或缺銅的培養條件下，漆酶的合成會受影響。

1.2 固體培養

固體培養就是利用固體培養基，在沒有或者含有少量液體的環境中，使菌絲體貼附在固體培養基質表面上生長和產酶的過程。隨著研究的不斷發展和深入，真菌固體培養產酶越來越受到國內外學者們的關注，研究和實踐表明，白腐菌固體發酵也能夠得到較高的漆酶產量，相比于液體發酵方式，固體培養的氧氣循環流通較好，有利于白腐菌等好氧真菌的生長代謝，而且由于是靜態處理過程，因此可以省去機械動力所消耗的能量，后續處理過程也較為簡便，并且這種培養方式與大部分真菌在野生狀態時的生長環境更為接近，因此特別適合于絲狀真菌的發酵產酶［39］。

1.3 白腐菌產漆酶研究的新趨勢

最近幾年，對于白腐菌產漆酶的研究，無論是液體培養還是固體培養都出現了一個新的特點，就是大量利用天然物質，特別是利用工農業生產中產生的木質纖維素有機副產品和廢棄物，作為白腐菌生長和產酶的培養底物。這些有機物主要包括麥麩、蔗渣、稻草、麥草、木屑、秸皮、酒糟、豆粕、玉米芯、脫墨污泥、葡萄藤和橄欖油廠廢水等，它們通常都富含糖類物質，能夠為菌體的生長代謝提供養料，并且還含有一定量的木素、纖維素和半纖維素 (表2)［16，39-40］，可作為刺激白腐菌分泌漆酶的誘導物。有報道指出［41］，小麥麩中還含有一種天然漆酶誘導物質——阿魏酸 (約0．4% ～1．0%)，對白腐菌分泌漆酶具有較強的誘導作用［4，18］。雖然到目前為止還未見有報道證實其他天然底物是否也含有某些特殊誘導物質，但是將這些天然有機物作為白腐菌發酵底物的可行性已經得到了廣泛的認同。

表2 幾種用于白腐菌漆酶發酵的有機副產物的木質纖維素含量

例如Membrillo等［27］采用不同顆粒尺寸的蔗渣作為培養底物，進行白腐菌Pleurotus ostreatus漆酶的固體發酵，發現蔗渣顆粒大小和外加氮源對漆酶產量有很大影響，最佳發酵條件為蔗渣濕度80%，顆粒直徑1．68 mm，纖維長徑比 8．7 ±1．1，外加氮源硫酸銨，碳氮比20，每克絕干底物發酵漆酶活力最高可達0．04 IU。Stajic等［16］利用桔皮和葡萄藤粉作為碳源，對多株白腐菌進行液體和固體培養，結果表明，在液體培養基中添加4%桔皮和20 mmol/L硫酸銨最適宜白腐菌Pleurotus eryngii分泌漆酶，培養基中酶活最高可達246．4 IU/L;而白腐菌Pleurotus ostreatus漆酶產量最高為445 IU/L，其最佳培養方式為固體培養，培養基含4 g葡萄藤粉，12 mL液體合成培養基(氮源為 30 mmol/L 硫酸銨)。Winquist等［25］將燕麥殼、纖維殘渣和脫墨污泥等3種工農業廢棄物作為白腐菌的固體發酵底物，發現培養基的成分對白腐菌產酶影響較大，在燕麥殼中加入20%的脫墨污泥能顯著提高白腐菌Cerrena unicolor的漆酶分泌能力，最高酶活達到178nkat/g(絕干質量)。

這些副產品和廢棄物來源十分廣泛，而且產量巨大，但是由于長期以來缺乏規?；厣罴庸ず屠?，大量寶貴的資源被作為初級產物而浪費，經濟附加值很低。而利用這些有機物作為白腐菌發酵漆酶的培養底物，不僅可以促進白腐菌生長，提高漆酶的產量，而且能夠充分利用低價值的工農業副產品和廢棄物，降低生產成本，減少對環境的污染負荷。

2 白腐菌漆酶的發酵方式

提高白腐菌漆酶的產量，并降低生產成本，使其在工農業生產中得到廣泛應用，還要依賴于成熟的工業化發酵技術。在實驗室研究時，搖瓶發酵雖然最為常用，但是由于其發酵規模相對較小并且缺乏對工程控制的選擇 (如pH值、通氣量、外加營養物質等)，具有一定的局限性，因此采用有適當控制和檢測儀器的小型發酵罐 (約1～10 L) 是較為合適的選擇［42］。但是在工業化生產中，缺乏高效的大規模發酵罐系統仍然是目前制約白腐菌漆酶生產和應用的一個關鍵性因素，為了解決這一問題，近年來國內外的科研工作者們設計了多種用于發酵罐生產漆酶的工藝和策略。按照培養方式的不同也可將它們概括為液體發酵和固體發酵兩大類。

2.1 液體深層發酵

發酵罐規模的微生物液體培養通常稱為深層發酵(Submerged fermentation，SmF)。機械攪拌式發酵罐(Stirred tank reactor，STR)是目前最常用的深層發酵設備，是已經形成標準化的通用設備，適合于大多數微生物的培養發酵過程。它結構簡單，不需要特殊設備，利用機械攪拌器的作用，使菌體、發酵液、空氣和熱量等充分混合，促進物料的均勻分布和氧氣的溶解，以保證供給微生物生長繁殖和代謝所需的營養、溫度和溶解氧等。但是這種發酵罐用于白腐菌的培養發酵時，還存在一些不利因素，主要表現在罐體中白腐菌菌體的生長不易控制，菌絲的無序擴張會提高發酵液的黏稠度，并且纏繞在攪拌葉輪上，堵塞管路，嚴重影響物料、熱量和氧氣的均勻傳遞。雖然可以通過提高攪拌轉速改善上述問題，但是過高的轉速會導致菌絲受到的剪切力增大，抑制細胞繁殖代謝和漆酶的分泌，甚至導致細胞破裂［7］。

針對傳統發酵工藝培養白腐菌的缺陷，很多研究者利用白腐菌的菌絲體具有向物體表面黏附的自然屬性，采用細胞固定化技術來控制白腐菌的自由生長，其最大的優勢是能夠使菌絲在發酵液中均勻分布，有利于簡化補料和后續進程的操作，以實現連續培養發酵。細胞固定化技術還能夠降低發酵液的黏稠度，改善氧氣的供給和物料的傳遞，保護菌絲細胞免受剪切力的作用，提高細胞對pH值、溫度、有毒物質等外界環境的抗干擾能力［7］，從而加快細胞的繁殖代謝，促進漆酶的分泌。常用的細胞固定載體主要有海藻酸鈉、殼聚糖、幾丁質、纖維素衍生物等天然聚合物和聚氨酯泡沫、尼龍海綿、不銹鋼海綿等惰性物質。Prasad等［44］報道采用聚氨酯泡沫固定化培養白腐菌Pleurotus ostreatus，能顯著提高漆酶產量，并將發酵體系擴大到280 mL填充床反應器 (Packed-bed bioreactor) 中，漆酶產量可達 1．4 IU/mL。Couto等［44］研究了多種載體在固定床反應器 (Fixed-bed bioreactor)分批發酵時對白腐菌漆酶產量的影響，結果表明，不銹鋼海綿最適合白腐菌Trametes hirsuta產漆酶，最高活力可達2．2 IU/mL。而 Shin等［45］指出，采用海藻酸鈉、殼聚糖等材料固定化培養白腐菌成本較高，不利于漆酶的大規模生產，因此他們選用麥麩、黃麻、大麻和楓木片等多種低價天然材料作為固定化載體，其中黃麻是最適合于白腐菌Trametes versicolor固定化發酵漆酶的天然載體。

此外，發酵罐規模的分批補料策略也是一種提高白腐菌漆酶產量的有效手段。補料培養是指根據菌株生長和初始培養基的性質，在培養發酵的某些階段適當補加培養基或營養物質，使菌體生長和代謝產物合成的時間相對延長。這種方法用于白腐菌產酶的優勢主要體現在能夠通過調節底物濃度來控制菌體的生長速度，降低代謝產物對菌體生長代謝的抑制作用，特別是避免某些使漆酶失活的蛋白水解酶的合成［7，37］。Galhaup等［46］的研究表明，在20 L機械攪拌式發酵罐中采用多次補料策略，機械攪拌只需要一個較低的轉速 (100 r/min)，白腐菌 Trametes pubescens的漆酶產量就可提高約2倍，達到相對較高的水平(740 IU/mL)。

2.2 固態發酵

白腐菌固態發酵 (Solid-state fermentation，SSF)的規模擴大化也越來越受到研究者的關注，Coute等［23，47］的課題組比較了3種采用不同傳質機理的發酵罐，分別是機械作用的浸入式反應器、氣動式的膨脹床反應器和靜置的盤式反應器，發現發酵罐傳質系統的不同對白腐菌漆酶產量影響較大，當采用大麥麩為非惰性底物時，盤式反應器更適合于白腐菌Trametes versicolor漆酶的生產，最高漆酶活力達到3．5 IU/mL，是其他兩種發酵罐中最高酶活的6倍。之后他們又采用桔皮作為固態發酵底物，結果表明，盤式反應器同樣適用于白腐菌Trametes hirsuta漆酶的生產，其最高酶活可達12 IU/mL。盤式反應器之所以優于其他兩種固態發酵罐，這些學者認為主要是由于浸入式和膨脹床反應器的傳質動作會對菌絲體產生一定的剪切力，影響了菌體的生長和代謝產酶，由此提出對于固態發酵罐，傳質系統的設計是影響產酶效率的關鍵因素。

目前國內外對于高效的固態發酵罐規模的白腐菌產漆酶報道仍比較少，這主要是由于固態發酵罐還面臨著一些難以克服的問題，除了傳質系統的設計外，發酵過程中pH值、溫度、通氣和氧氣傳遞、濕度、攪動等參數不易控制也是相當重要的原因。因此，當前的研究主要集中于改良已有固態發酵罐系統或設計開發新型發酵設備和工藝，例如Boehmer等［48］研究者采用新型 RITA(Recipient Immersion Temporaire Automatique)間歇浸入式系統，將在固體底物上生長的菌絲體間歇浸入含染料的液體培養基中，以提高白腐菌發酵產酶的效率并同時對染料進行脫色，其優勢是既避免了對菌體的機械剪切作用，又能夠克服代謝產物及有機染料對菌體生長和產酶的抑制作用。

3 總結與展望

綜上所述，白腐菌漆酶的液體和固體發酵分別具有各自的特點，目前關于哪種方法更具優勢尚無明確定論，因此它們仍然會是今后一段時間內漆酶生產研究的兩個主要方向。同時，采用工農業生產中的木質纖維素有機副產品和廢棄物，作為白腐菌菌體生長和分泌漆酶的培養底物，也已經得到了廣大研究者們的認同，成為漆酶研究領域的一個新趨勢。

但是，目前白腐菌產漆酶的研究總體上還處于由實驗室研究向工業化生產的過渡階段，生產成本較高和缺乏高效的大規模發酵系統仍然是限制漆酶工業化生產和應用的關鍵因素，因此，今后的科研工作除了繼續設計、改良和優化各種類型的發酵體系，深入系統地研究其發酵參數的控制及動力學模型，以使之更加完善高效外，還應該通過應用各種最新的生物科學技術，特別是基因克隆和重組技術來開拓白腐菌漆酶研究的新方法和新思路，從根本上提高白腐菌生長和產酶能力。

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(責任編輯：馬 忻)

Research Progress of Laccase Production by Lignin-degrading White Rot Fungi

FU KaiFU Shi-yu*ZHAN Huai-yu
(State Key Lab of Pulp＆ Paper Engineering，South China University of Technology，Guangzhou，Guangdong Province，510640)
(*E-mail：shyfu@scut．edu．cn)

Laccase is one of the ligninolytic enzymes secreted by white rot fungus which is the most important microorganism involved in degrading lignin in nature．Application of laccase to pulp bleaching is an attractive alternative to decrease chemicals demand and wastewater pollution．Therefore，the production of laccase in high yield has

much attention from researchers in past decades．The research progress of laccase production from white rot fungi in recent years is overviewed in this paper．Several effective methods to improve laccase yield in submerged and solid-state fermentation are mainly discussed，and the prospect of such research field in the future is also presented．

white-rot fungi;laccase;submerged fermentation;solid-state fermentation;organic waste;fermentor

Q55

A

0254-508X(2011)03-0065-06

傅 愷先生，在讀博士研究生;主要研究方向：制漿造紙生物技術。

2010-12-01(修改稿)

國家自然科學基金 (30771689);廣東省科技計劃項目(2007B031600002)。