游離輕鏈檢測對多發性骨髓瘤診斷的臨床意義

翟玉華,梁玉芳,陳文明,王清濤

(1.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院檢驗科,北京100020;2.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院血液科)

多發性骨髓瘤(MM)是一種好發于中老年的單克隆漿細胞異常增生的惡性疾病。其發病率隨年齡增長而增加。克隆性漿細胞病患者血清及尿中常出現游離輕鏈。其分子量小,合成速度略快于重鏈。在與重鏈結合后有部分輕鏈游離于血中,正常人維持在低濃度水平,而在多發性骨髓瘤時游離輕鏈大量增加。實驗室常以本周氏蛋白陽性與否來判斷是否有游離輕鏈。而本周氏蛋白(尿中游離輕鏈)檢測受多種因素的影響[1](如患者的腎臟功能及尿量),而血清游離輕鏈在判斷患者病情、監測療效等方面優于尿輕鏈。該檢測在國外已較廣泛地應用于漿細胞增殖性的診斷和監測中,其檢測的靈敏度高,特異強[2-4]。本實驗室將以骨髓瘤患者為對象,評價幾種常用檢測方法,在診斷、療效觀察及預后判斷中的應用前景。

1 材料與方法

1.1 樣本 MM患者標本完整免疫球蛋白型29例(包括IgG、IgA 、IgD 型),輕鏈型21例,來自2006年6月-2008年11月我院及外院門診及住院送檢標本,臨床明確診斷為多發性骨髓瘤患者均符合臨床診斷標準。

1.2 試劑與儀器

美國BECKMAN公司1MMAGE雙光徑免疫分析儀和BECKMAN公司原裝免疫球蛋白及輕鏈檢測試劑;法國Sebia HYDRASYS全自動電泳儀及原裝試劑,進行血清蛋白電泳,免疫固定電泳檢測;英國Binding site公司Free Kap、Free Lam試劑。在美國BECKMAN公司 1MMAGE雙光徑免疫分析儀上檢測。

1.3 方法

1.3.1 采集患者空腹不抗凝靜脈血5 ml,2 500 r/min離心5分鐘分離血清。用以上試劑及儀器以速率散射比濁法定量檢測IgG、IgA、IgD及輕鏈Kappa、Lamda。

1.3.2 24小時尿標本混勻記尿量,送檢10 ml。用以上試劑及儀器以速率散射比濁法定量檢測尿中輕鏈Kappa、Lamda。比值明顯異常且免疫固定電泳中與抗κ輕鏈或抗λ輕鏈血清形成致密濃染的沉淀帶為本周陽性。

1.3.3 血清蛋白電泳:取10 μ l血清標本于加樣梳在瓊脂糖凝膠板上電泳,干燥,染色,脫色,烘干,掃描。在α 2-γ區可見單克隆區帶為M成份檢測陽性。

1.3.4 免疫固定電泳:血清標本的M蛋白濃度預稀釋成1.5 g/l左右再進行IFE,取已稀釋好10 μ l標本于加樣梳在瓊脂糖凝膠板上電泳后,依次加入固定劑 、抗 IgG 、抗 IgA 、抗IgM 、抗IgD,抗 κ輕鏈,抗 λ輕鏈血清各10 μ l。孵育固定沉淀蛋白,再吸去多余的抗血清,烘干,染色,脫色,烘干,觀察結果。與抗體結合的免疫球蛋白將沉淀在凝膠中,其他蛋白可被洗去。再用酸性結晶紫或氨基黑染色后即可在凝膠上顯現出不同型的免疫球蛋白及其相對含量。若有單克隆成份的免疫球蛋白存在時會在某一抗血清的泳道上形成致密濃染的沉淀帶。

1.3.5 英國Binding site公司Free Kap、Free Lam試劑在BECKMAN公司1MMAGE雙光徑免疫分析儀上定量檢測(嚴格按說明書要求操作)。血清檢測結果判定參考區間:游離κ 8.9-25.5(mg/L)游離λ 12.5-33.6(mg/L)游離κ/λ0.49-1.07。游離κ/λ超出范圍為陽性[1]。

2 結果

50例標本其中LCMM患者21例,IIMM患者29例(包括IgG、IgA及IgD型)。患者標本做血清免疫固定電泳輕鏈檢測,尿輕鏈定量檢測及血清游離輕鏈檢測。對于21例LCMM患者,三種方法游離輕鏈陽性率分別為90.5%(19/21),80.9%(17/21),100%(21/21),對于29例IIMM患者游離輕鏈陽性率分別為 20.7%(6/29),41.4%(12/29),82.7%(24/29),見表1、表2、圖1。(注:免疫固定電泳法是用血清免疫固定試劑而非本周氏免疫固定試劑)。

3 討論

圖1 血尿蛋白電泳區帶,掃描圖及免疫固定電泳圖

表1 LCMM與IIMM血清IFE輕鏈檢測、尿本周蛋白檢測、血游離輕鏈檢測結果

表2 IIMM患者血清IFE輕鏈檢測、尿本周蛋白檢測、血游離輕鏈檢測結果

免疫球蛋白重鏈與輕鏈結合時,輕鏈分子量小,其合成速度略快于重鏈,在與重鏈組裝成完整的免疫球蛋白分子后會有部分輕鏈游離于血液中,可自由通過腎小球濾過膜而被濾出。因此血清及尿中理論上都有少量的游離輕鏈(FLC,Free light chain)。以往的檢測方法缺乏針對游離輕鏈特異的單克隆抗體因此受檢測靈敏度限制低濃度游離輕鏈常常為陰性。目前檢測血清FLC采用針對輕鏈上隱藏位點的多克隆抗體,特異結合FLC,特異性及靈敏性高,可檢測低濃度的FLC。人類產κ輕鏈的漿細胞是產λ輕鏈的兩倍。一般情況下κ以單體、λ以二聚體形式存在,腎臟對κ以單體濾過速度大約是λ二聚體的三倍,因此盡管κ的產量較λ的多,但血清中λ的濃度高于κ。多發性骨髓瘤(MM)是一種起源于前B細胞的骨髓漿細胞惡性增殖性疾病。其表現為骨髓中存在大量惡性漿細胞,這些細胞分泌大量的單克隆免疫球蛋白(M-蛋白),過量分泌且發生組裝障礙,而出現重鏈和游離輕鏈大量并存的現象。

用檢測血清游離輕鏈方法檢測骨髓瘤患者伴隨輕鏈可高達90%。盡管血清免疫固定電泳酸性結晶紫染色對單克隆免疫球蛋白的檢出敏感性為25 mg/dl,能檢測出非常少的單克隆成份,但在重鏈型多發性骨髓瘤樣本中由于高濃度單克隆免疫球蛋白的存在做免疫固定電泳時加大稀釋倍數,使得與重鏈相比濃度較低的游離輕鏈在稀釋過程中與抗輕鏈血清結合的濃度過低,又有相當部分游離輕鏈排泄于尿中。因此在用血清免疫固定電泳法檢測時常常看不到游離輕鏈的沉淀帶,此方法的游離輕鏈陽性檢出率低。

約有40%的IgD型MM患者常出現在抗輕鏈的泳道上形成兩條單克隆成份,經免疫固定電泳證實此兩條區帶,一條為與IgD結合的輕鏈,另一條為游離輕鏈。由于臨床上IgD型MM較其它型少,且正常人體內IgD水平極低,即使IgD型MM患者血清中IgD成倍增長但總IgD水平仍偏低,相當一部分患者在做血清免疫固定電泳時與其它完整型MM比較會減少稀釋倍數因此在IFE中可見有游離輕鏈致密條帶者可達40%。

輕鏈型骨髓瘤患者標本在做免疫固定電泳中無與重鏈抗血清結合的條帶,而與某一型抗輕鏈血清結合形成致密條帶。由于小分子輕鏈生成,通過腎小球濾至尿內出現本周蛋白。血清中輕鏈濃度往往不高在做血清免疫固定電泳時會減少稀釋倍數因此在IF中可見無與重鏈抗血清結合的條帶,而與某一型抗輕鏈血清結合形成致密條帶者可高達90%。

血清游離輕鏈檢測不存在上述做免疫固定電泳所需按重鏈濃度稀釋問題,并且為定量檢測,且游離κ和λ不受腎臟功能及尿量影響,有較好的特異性和靈敏性,在骨髓瘤伴隨輕鏈的檢測及懷疑病人有單克隆的FLC產生時應首先用血清FLC定量檢測來提高疾病的檢出率,FLC在體內的半衰期短,用于監測治療,可及時判斷早期復發及微小殘留病[5,6],有很高的臨床實用價值。

目前血清免疫固定電泳法,在克隆性漿細胞病的免疫分型中,有不可取代的作用,結合血清游離輕鏈定量檢測對多發性骨髓瘤患者的明確診斷、療效觀察及改善預后起重要作用。

[1]梁玉芳,陳文明,王清濤.血清游離輕鏈檢測及其應用[J].中華檢驗醫學雜志,2007,30:1298.

[2]Kang SY,Suh JT,Lee HJ,et al.Clinical usefulness of free light chain concentration as a tumor marker in multiple myeloma[J].Ann Hematol,2005,84:588.

[3]Bradwell AR,Carr-Smith HD,Mead GP,et al.Serum test for assessment of patients with Bence Jones myeloma[J].Lancet,2003,361:489.

[4]Nowrousian MR,Brandhorst D,Sammet C,et al.Serum analysis and urine immunofixation electrophoresis in patientswith multiple myeloma[J].Clin Cancer Res,2005,11:8706.

[5]Mead GP,Carr-Smith HD,Drayson MT,et al.Serum free light chain for monitoring multiple myeloma[J].Br J Haematol,2004,126:348.

[6]Bradwell AR,Carr-Smith HD,Mead GP,et al.Highly sensitive,automated immunoassay for immunoglobulin free light chain in Serum and urine[J].Clin Chem,2001,47:673.