響應面法優化酶法制備酪蛋白糖巨肽的工藝條件

王艷萍，趙運星，張伊然，尚 柯

(食品營養與安全教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457)

響應面法優化酶法制備酪蛋白糖巨肽的工藝條件

王艷萍，趙運星，張伊然，尚 柯

(食品營養與安全教育部重點實驗室，天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457)

采用M initab方法設計實驗，對影響酪蛋白糖巨肽制備的酶解因素進行優化，發現酶解時間、酶解溫度、酶解pH、酶與底物比是影響酶解酪蛋白的主要因素．由于唾液酸是酪蛋白糖巨肽的特征性組分，本文以唾液酸的含量表征酶解上清液中酪蛋白糖巨肽的含量．根據M initab分析的結果，采用Design Expert 軟件中水平設計和響應面分析法對影響酪蛋白糖巨肽產量的主要因素進行優化，建立唾液酸含量A580對酶解主要條件的二次回歸模型，其回歸方程的決定系數達到了0.962,9．得到的最佳酶解條件為：酶解時間80,m in，酶解溫度42.5,℃，酶解pH 6.28，酶與底物比270,U/g．唾液酸含量A580最高為0.653，此時酪蛋白糖巨肽的得率為17.91 mg/g．

酪蛋白糖巨肽；酶解；條件優化；響應面分析

Abstract：The effect of enzyme hydrolysis conditions on casein glycomacropeptide was selected w ith M initab software. It was showed that the principal factors were hydrolysis time，temperature，pH，and [E]/[S]. The main effect of enzyme hydrolysis conditions was optim ized by Design Expert system. The regression equation was established by expressing relationship between sialic acid and main factors of enzyme hydrolysis conditions. The R-squared in the model of regression equation was 0.962,9，which meant the established equation could predict the A580of sialic acid(under the absorbance at 580 nm by Resorcinol-HCl test)well w ithin the range of conditions. The optimum enzyme hydrolysis conditions were：time 80 m in，temperature 42.5,℃，pH 6.28，[E]/[S] 270,U/g. The A580of sialic acid was 0.653，while the yield of CGMP was 17.91 mg/g casein under the optimal conditions.

Keywords：casein glycomacropeptide；enzyme hydrolysis；optim ize condition；response surface analysis

酪蛋白糖巨肽(casein glycomacropeptide，CGMP)是Delfour 等[1]于1965 年發現的一種含有唾液酸的糖肽，是乳中 κ–酪蛋白(κ-CN)上的一個多肽片段．由于κ–酪蛋白是酪蛋白中唯一含有糖成分的蛋白質，而唾液酸(N–乙酰神經氨酸)主要集中在CGMP上[2]，所以可以用測定唾液酸的含量來鑒定樣品中是否含有CGMP，同時根據唾液酸含量的多少來表征CGMP的含量．CGMP的化學組成獨特，不含有苯環氨基酸且帶有含唾液酸的低聚糖糖鏈，因而具有許多重要的生理活性功能，如結核霍亂毒素和大腸桿菌毒素、抑制細菌和病毒的黏附作用、抑制胃液分泌、促進雙歧桿菌增殖、調節免疫系統等，所以CGMP是極具研究價值的[3–4]．

目前報道的酪蛋白糖巨肽的制備方法主要有直接提取法、酶解法、基因工程法．酶解法是目前制備活性肽常用的方法[5–7]．對于酶解制備酪蛋白糖巨肽的研究中，主要運用單因素實驗結合正交實驗來確定酶解條件[8]，存在著勞動量大、費時費力等問題．本文利用M initab和Design Expert兩種軟件設計優化酶解制備酪蛋白糖巨肽的條件，對影響酶解制備酪蛋白糖巨肽的主要因素進行考察，同時對這些主要因素進行優化，為工業制備CGM P的研究提供基礎理論數據．

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

酸凝干酪素，蘭州隴朊干酪素有限責任公司；復合酶，天津市諾奧科技發展有限公司．

DELTA–320型酸度計，Mettler Toledo公司；UV–9100 型紫外分光光度計，北京瑞利分析儀器公司；高速冷凍離心機，Backman公司．

1.2 方法

1.2.1 CGMP粗品的制備

配制3%的酪蛋白溶液于250,m L小燒杯中，用6,mol/L的鹽酸調節pH，在不同溫度下水浴保溫30,min，加入復合酶，立即計時．保持反應過程中反應液的pH為初始pH，反應完的酶解液在75,℃下水浴30,m in 終止酶反應．冷卻后，使用6,mol/L的NaOH溶液調整酶解液的pH為4.6，4,000,r/m in離心30,m in，收集上清液，備用．

1.2.2 CGMP的鑒定

本實驗用間苯二酚–鹽酸法[9]測定唾液酸的含量．

1.2.3 部分因子實驗設計

根據復合酶的性質，本實驗選取酶解溫度、酶解時間、酶與底物比、酶解pH、CaCl2質量濃度作為部分因子實驗設計的因素，以間苯二酚–鹽酸法測定唾液酸在580,nm下的吸光度A580為響應指標，采用5因素2水平4中心點的1/2部分因子實驗設計，篩選影響酶解條件的主要因素．

1.2.4 CCD中心組合響應面設計

按照部分因子設計篩選出的影響復合酶酶解制備酪蛋白糖巨肽的主要因素，并以此作為響應面設計的因素，以間苯二酚–鹽酸法測定唾液酸在580,nm下的吸光度A580為響應指標，采用Design Expert[10–11]軟件中的CCD(central composite design)實驗設計．根據模型方差分析和可行度分析，確定模型的可行性和適用性后，得出復合酶酶解干酪素制備酪蛋白糖巨肽的最佳條件，并進行驗證實驗．

2 結果與討論

2.1 顯著影響因子的篩選

部分因子分析法篩選影響復合酶酶解制備酪蛋白糖巨肽的主要因素，即：酶解溫度(A)、酶解時間(B)、酶與底物比(C)、酶解pH(D)、CaCl2質量濃度(E)，實驗設計及結果見表1．實驗各因素的影響效果見表2．

表1 n＝20的部分因子實驗設計及結果Tab.1 Experimental design and results for FFD as n＝20

表2 實驗各因素的影響效果(α＝0.05)Tab.2 Effect of factors on response of experim ent(α＝0.05)

表2中可以看出，酶解溫度、酶解時間、酶與底物比、酶解pH的P值都小于0.05，對復合酶酶解制備酪蛋白糖巨肽具有顯著影響．M initab軟件同時給出柏拉圖分析．設定 α＝0.05，即篩選顯著效應可信度在90%以上，相應的效應值在2.160以上的變量，柏拉圖中表現為超過2.160的因素對酶解制備酪蛋白糖巨肽的影響顯著，表示可信度在90%以上．得到同表2相同的結論，篩選得到顯著因素為酶解溫度、酶解時間、酶與底物比、酶解pH，而其余因素因其效應值均小于2.160，對復合酶酶解制備酪蛋白糖巨肽的影響較小，無需進一步優化其添加量．

進一步對該實驗設計進行方差分析，結果見表3．

表3 回歸方程方差分析表Tab.3 Variance analysis of regression equation

由表3方差分析可知P＝0.002＜0.01，可見回歸擬合良好，分析結果可信．酶解溫度、酶解時間、酶與底物比、酶解pH對復合酶酶解干酪素制備酪蛋白糖巨肽有顯著影響，其水平需要進一步優化．

2.2 響應曲面實驗設計

固定CaCl2濃度不變，對酶解溫度、酶解時間、酶解pH、酶與底物比進行4因素中心組合響應面分析實驗．利用Design Expert軟件對實驗數據進行二次多元回歸擬合，得到A580對編碼自變量A、B、C、D的二次多項回歸方程A580＝0.56＋0.044A＋0.065B－0.02C＋0.030D＋0.036AB－0.046AC＋0.081AD＋0.001BC＋0.042BD－0.022CD－0.090A2＋0.011B2－0.069C2－0.008D2．同時得到方差分析表(表4)．

表4 CCD回歸模型方差分析Tab.4 Variance analysis of CCD

由表4可知，對于模型P＝0.003,6＜0.01，表明該模型高度顯著，不同處理間差異顯著；對于失擬項P＝0.396,2＞0.05，差異不顯著，說明該模型的擬合度良好，可以根據該回歸方程來繪制響應面立體分析圖，考察所擬合的相應曲面的形狀．

響應面立體圖如圖1—圖6所示，利用該組圖可以對影響復合酶酶解干酪素制備酪蛋白糖巨肽的任何兩種因素的交互效應進行分析和評價，并確定最佳因素水平范圍．

圖1 酶解pH與底物比的交互作用Fig.1 Interaction between pH and [E]/[S]

圖2 酶解時間與底物比的交互作用Fig.2 Interaction between times and [E]/[S]

圖3 酶解時間和酶解pH的交互作用Fig.3 Interaction between times and pH

圖4 酶解溫度與底物比的交互作用Fig.4 Interaction between temperature and [E]/[S]

圖5 酶解溫度與酶解pH的交互作用Fig.5 Interaction between tem perature and pH

圖6 酶解溫度與酶解時間的交互作用Fig.6 Interaction between tem perature and times

由響應面圖可知：在本實驗水平范圍內，A580隨著酶解條件中酶解pH、酶解溫度、酶與底物比和酶解溫度的增大而增大，但當其超出一定范圍時，反而使A580降低或不再增加，所以每種條件都有一個最優的范圍，其最佳酶解條件為：酶解溫度42.5,℃，酶解時間80,m in，酶解pH 6.28，酶與底物比270,U/g．在此條件下A580為0.653．為了檢驗模型預測的準確性，在最佳酶解條件下進行3次酶解實驗，其A580分別為0.640、0.656、0.661，可見該模型能較好地預測實際酶解情況．

3 結 語

利用M initab軟件進行實驗設計，能夠在較少的實驗次數條件下快速找出主因素，利用CCD響應面設計能夠快速對主因素進行優化，得到最大響應值．本實驗得到制備CGMP的最佳酶解條件為：酶解溫度42.5,℃，酶解時間80,m in，酶解pH,6.28，酶與底物比270,U/g．在此條件下測得的A580為0.653，此時上清液中CGMP得率為17.91,mg/g．

［1］ Delfour A，Jolles J，A lais C，et al. Caseino-glycopeptides：Characterization of a methionin residue and of the N-term inal sequence[J]. Biochem ical and Biophysical Research Communications，1965，19(4)：452–455.

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Optim ize Conditions for Casein Glycomacropeptide Production by Enzyme Hydrolysis Using Response Surface M ethodology

WANG Yan-ping，ZHAO Yun-xing，ZHANG Yi-ran，SHANG Ke
(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，M inistry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

TS201.2

A

1672-6510(2011)02-0001-04

2010–10–29；

2011–01–13

天津市應用基礎及前沿技術研究計劃項目(08JCYBJC01900)

王艷萍（1962—），女，天津人，教授，博士，ypwang@tust. edu.cn.