紫甘薯花色苷對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的作用

曹東旭，董海葉，李 妍，呂曉玲

(1. 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2. 天津市食品加工工程中心，天津 300457)

紫甘薯花色苷對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的作用

曹東旭1,2，董海葉1，李 妍1，呂曉玲1

(1. 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；2. 天津市食品加工工程中心，天津 300457)

以人肝癌細(xì)胞HepG2為模型研究紫甘薯花色苷的抗腫瘤活性．通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)紫甘薯花色苷對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期變化．MTT結(jié)果表明，不同濃度的紫甘薯花色苷處理HepG2細(xì)胞24、48、72,h后，低濃度的紫甘薯花色苷促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，高濃度的紫甘薯花色苷抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，800,μg/m L花色苷處理72,h抑制率高達(dá)80%．HE染色結(jié)果表明，正常HepG2細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)清晰可見(jiàn)，而加入花色苷后，出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)濃集于核膜表面、形成新月形致密小斑塊、細(xì)胞膜形態(tài)變得不規(guī)則等凋亡的特征．流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明，花色苷能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，且細(xì)胞的凋亡率隨花色苷濃度的增加而增大．

紫甘薯花色苷；HepG2細(xì)胞；抗腫瘤

Abstract：The anti-tumor activity of purple sweet potato anthocyanin to human liver cancer HepG2 cells was studied. Cell viability，morphology characteristic and cell cycle distribution were analyzed by MTT experiment，HE dyeing and flow cytometry，respectively. The MTT results indicated that after being treated w ith purple sweet potato anthocyanin for 24，48，72,h，the grow th of HepG2 cell was slightly promoted by low concentration of purple sweet potato anthocyanin and obviously inhibited by high concentration of purple sweet potato anthocyanin. The cell grow th inhibitory rate could reach up to 80% when HepG2 cells were treated w ith 800,μg/m L of anthocyanin for 72,h. The HE dyeing results indicated that the normal HepG2 cell nucleus and cytoplasm are clearly discernible，while after being treated w ith anthocyanin，HepG2 cells showed typical morphological changes associated w ith the characters of apoptosis，such as karyopyknosis，the chromatin enrich in the karyotheca surface，form ing the meniscus compact small mottling，the cell membrane shape becomes anomalous. Flow cytometry analysis results indicated that the anthocyanin could induce cell apoptosis，and the apoptotic percentage increased along w ith the anthocyanin concentration.

Keywords：purple sweet potato anthocyanin；HepG2 cells；anti-tumor

花色苷是一類廣泛地存在于植物中的水溶性天然色素，是一大類多酚化合物的總稱，也是植物的主要呈色物質(zhì)[1]．何會(huì)等[2]研究了荔枝皮色素提取液中花色苷的抗氧化能力，分別測(cè)定花色苷的總抗氧化能力(TAC)，清除羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基的能力，結(jié)果表明花色苷具有極佳的抗氧化能力．吳信子等[3]測(cè)定了花色苷的氧自由基吸收能力，發(fā)現(xiàn)在14種花色苷中，花青素具有最高活性，其活性比傳統(tǒng)抗氧化劑維生素E強(qiáng)得多．近年來(lái)花色苷抗腫瘤的作用越來(lái)越受到人們的關(guān)注，有研究表明花色苷對(duì)人腫瘤細(xì)胞有殺傷作用，對(duì)多種癌細(xì)胞如乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞等都具有不同程度的抑制作用[1]．然而，花色苷抑制人肝癌細(xì)胞HepG2 增殖、誘導(dǎo)凋亡作用的機(jī)制尚不清楚，本文以HepG2細(xì)胞為模型，初步探討紫甘薯花色苷對(duì)肝癌細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)，為肝病的預(yù)防、治療及保肝功能食品的開(kāi)發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材料

紫甘薯花色苷為本學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提取[4–5]，樣品Ⅰ色價(jià)為40.7，樣品Ⅱ色價(jià)為85．

細(xì)胞株為人肝癌細(xì)胞HepG2，南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院．

主要試劑：胎牛血清，杭州四季青生物工程有限公司；青霉素、鏈霉素，哈藥集團(tuán)制藥總廠；MTT(噻唑藍(lán))，Sigma公司；二甲基亞砜(DMSO)，天津市化學(xué)試劑一廠．

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將HepG2細(xì)胞接種于含10%滅活胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基(Gibico公司)中，置37,℃、飽和濕度CO2,5%的2123TC型水套式CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Shellab公司)中恒溫培養(yǎng)，2～3,d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)．

1.3 HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的測(cè)定

采用MTT法進(jìn)行測(cè)定．取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞調(diào)整濃度為105,m L–1，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100,μL．培養(yǎng)24,h后倒掉培養(yǎng)基，用PBS洗2次，實(shí)驗(yàn)組加入終質(zhì)量濃度分別為25、50、100、200、400、800,μg/m L的紫甘薯花色苷200,μL，對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)平行孔．培養(yǎng)24、48、72,h后倒掉紫甘薯花色苷溶液，用PBS洗2次，每孔加入質(zhì)量濃度為0.5,mg/m L的MTT,200,μL．繼續(xù)培養(yǎng)4,h后倒掉上清液，用PBS洗2次，每孔加入DMSO,150,μL，振蕩使紫色結(jié)晶物充分溶解．在酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)570,nm處各孔的吸光度，進(jìn)行不同色價(jià)紫甘薯花色苷的實(shí)驗(yàn)及其吸光度的測(cè)定．

抑制率＝(1－A加藥孔/A對(duì)照孔)×100%

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察[6–10]

用HE染色方法觀察細(xì)胞形態(tài)．取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，調(diào)整其濃度為105,m L–1，接種于底部鋪有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，每孔2,m L．培養(yǎng)12,h待細(xì)胞貼壁后吸走培養(yǎng)基，用PBS洗2次，加入紫甘薯花色苷樣品Ⅰ使終質(zhì)量濃度分別為100、200、400、800,μg/m L，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組．培養(yǎng)24,h后取出蓋玻片，固定前先用PBS清洗細(xì)胞2次(1 000 r/m in離心5 m in，棄去上清液)，去除妨礙染色的血清．用10%甲醛固定細(xì)胞40,m in．蒸餾水洗1次后，滴入蘇木精染液作用3,m in．加入0.5%鹽酸–70%乙醇溶液作用1,m in，脫去胞質(zhì)的著色，此時(shí)核呈紫紅色．加入堿性溶液堿化，使細(xì)胞核變成藍(lán)色．用自來(lái)水(呈弱堿性)浸泡5,m in．蒸餾水洗作用1,m in，去除殘留的堿性溶液，否則影響伊紅著色．加入伊紅染液作用1,m in．用梯度乙醇溶液脫水：70%、90%、95%的乙醇各脫水45,s，100%乙醇脫水2次，每次2,m in．用二甲苯透明細(xì)胞2次，每次5,m in．樹(shù)膠封固，即將蓋玻片用樹(shù)膠粘于載玻片上，以利保存和觀察．

1.5 細(xì)胞周期測(cè)定[10–11]

分別取終質(zhì)量濃度為100、200、400、800,μg/m L紫甘薯花色苷樣品Ⅰ處理的HepG2細(xì)胞各105,m L–1，用PBS洗2次后將細(xì)胞重懸于1,m L,PBS中，緩慢滴入預(yù)冷的2.3,m L,100%乙醇中，于4,℃冰箱固定18,h．離心去除乙醇，將細(xì)胞用PBS洗2次，重懸于1,m L,PBS中．加入20,μL,PI染液、5,μL的RNaseA室溫避光作用1 h．加2.5,m L PBS稀釋300目濾膜過(guò)濾．流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dickinson公司)測(cè)定細(xì)胞周期，用熒光共聚焦顯微鏡(日本尼康公司)觀察細(xì)胞的凋亡情況．

2 結(jié)果與討論

2.1 MTT法的檢測(cè)結(jié)果

終質(zhì)量濃度為25、50,μg/m L紫甘薯花色苷作用HepG2細(xì)胞后，花色苷促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng)，25、50,μg/m L樣品Ⅰ作用HepG2細(xì)胞24、48,、72,h的促進(jìn)率分別為15%、10%、6%和9%、5%、3%．25、50,μg/m L樣品Ⅱ作用HepG2細(xì)胞24、48、72,h的促進(jìn)率分別為12%、8%、3%和6%、4%、1%．

由圖1(a)可知：在100、200、400、800,μg/m L紫甘薯花色苷樣品Ⅰ作用HepG2細(xì)胞24,h后，抑制了細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制率分別為8%、19%、27%和36%；在加藥培養(yǎng)48 h后，抑制率達(dá)到23%、31%、48%和61%；800,μg/m L紫甘薯花色苷與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)72,h，抑制率達(dá)到75%．其中24、48、72,h的IC50值分別為2 253±11.9，459±13.75和199±13.5．

MTT法測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率顯示，在100～800,μg/m L紫甘薯花色苷樣品Ⅰ對(duì)HepG2細(xì)胞有明顯的抑制作用．紫甘薯花色苷樣品Ⅰ在25～800,μg/m L具有以下特點(diǎn)：紫甘薯花色苷低濃度促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，高濃度抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，其抑制作用隨藥物濃度的增大而增大，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增大．

由圖1(b)可知：在終質(zhì)量濃度為100、200、400、800,μg/m L紫甘薯花色苷樣品Ⅱ作用HepG2細(xì)胞24,h后，抑制率分別為12%、23%、30%和38%；在加藥培養(yǎng)48,h后，抑制率達(dá)到25%、40%、52%和63%，800,μg/m L 紫甘薯花色苷與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)72,h，抑制率達(dá)到80%．其中24、48、72,h的IC50值分別為2,039±8.25、399±12.50和151±12.75．

圖1 花色苷對(duì)HepG2細(xì)胞的影響Fig.1 Effect of anthocyanin on HepG2 cells

實(shí)驗(yàn)中所用的紫甘薯花色苷樣品Ⅱ的色價(jià)要高于紫甘薯花色苷樣品Ⅰ的色價(jià)，結(jié)果顯示紫甘薯花色苷樣品Ⅱ的抑制率明顯高于樣品Ⅰ的抑制率，可見(jiàn)在本實(shí)驗(yàn)中所使用的紫甘薯花色苷濃度范圍內(nèi)，色價(jià)不同其抑制率也明顯不同，色價(jià)越高，抑制率越強(qiáng)．

紫甘薯花色苷是類黃酮化合物，可能通過(guò)阻止腫瘤細(xì)胞增殖生長(zhǎng)、降低金屬蛋白酶的活力、激活JNK途徑、阻止活性氧和致癌物以及DNA加合物的作用，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡．紫甘薯花色苷濃度越高，抑制效果越明顯．而MTT法測(cè)定低濃度的紫甘薯花色苷組表現(xiàn)出促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的結(jié)果，這可能是由紫甘薯花色苷本身顏色與MTT實(shí)驗(yàn)中生成的紫色結(jié)晶顏色相近造成的吸光度偏高．

2.2 HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化

HE染色觀察到的細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖2．

圖2 HepG2 細(xì)胞形態(tài)Fig.2 HepG2 cells morphology

正常細(xì)胞形態(tài)呈貼壁狀態(tài)比較良好的菱形，細(xì)胞核呈藍(lán)色清晰可見(jiàn)，細(xì)胞質(zhì)呈微紅色．加入藥物處理后細(xì)胞呈現(xiàn)貼壁不太牢固的橢圓形，且形態(tài)大小不一．深藍(lán)色的顆?？赡苁氢}鹽顆粒，灰藍(lán)色的為細(xì)胞核黏液，鮮紅色的顆粒為胞漿內(nèi)嗜酸性顆粒，而粉紅的為蛋白質(zhì)液體．加藥處理后的細(xì)胞由于其細(xì)胞膜的損壞，由輕度嗜堿呈現(xiàn)嗜伊紅濃染，伊紅著色由淺變深．200,μg/m L紫甘薯花色苷處理細(xì)胞，部分細(xì)胞核已消失，染色質(zhì)濃集于核膜表面，形成新月形致密小斑塊，細(xì)胞膜形態(tài)變得不規(guī)則．800,μg/m L紫甘薯花色苷處理的細(xì)胞，大部分細(xì)胞已經(jīng)不能維持原來(lái)的形態(tài)，很多碎裂出現(xiàn)凋亡晚期的特征．

2.3 細(xì)胞周期的變化

終質(zhì)量濃度為100、200、400、800,μg/m L紫甘薯花色苷樣品Ⅰ作用于HepG2細(xì)胞24,h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示．

在實(shí)驗(yàn)所取紫甘薯花色苷濃度范圍內(nèi)，隨著紫甘薯花色苷濃度的增加，其抑制效果明顯增強(qiáng)，呈濃度依賴關(guān)系，在紫甘薯花色苷質(zhì)量濃度分別為100、200、400、800,μg/m L時(shí)，細(xì)胞凋亡率分別為4.59%、20.87%、27.05%和33.92%．

圖3 花色苷樣品Ⅰ對(duì)HepG 2細(xì)胞周期的影響Fig.3 Effect of anthocyanin samp le Ⅰ on HepG2 cell cycle

3 結(jié) 論

(1),通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，紫甘薯花色苷能夠顯著抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制率與濃度、時(shí)間成劑量依賴性．

(2),HE染色觀察HepG2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，花色苷質(zhì)量濃度為100、200,μg/m L時(shí)，細(xì)胞逐漸變圓，細(xì)胞核固縮，當(dāng)花色苷質(zhì)量濃度為400、800,μg/m L時(shí)，細(xì)胞膜基本破裂，幾乎不能維持細(xì)胞形態(tài)．

(3),流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期，分析得出紫甘薯花色苷對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡率的影響，即細(xì)胞凋亡比例隨著花色苷濃度增大而增大．

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Effect of Purp le Sweet Potato Anthocyanin on Human Liver Cancer HepG2 Cells

CAO Dong-xu1,2，DONG Hai-ye1，LI Yan1，Lü Xiao-ling1
(1. College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2. Tianjin Food Engineering Center，Tianjin 300457，China)

TS202.3

A

1672-6510(2011)02-0009-04

2010–10–08；

2010–12–28

曹東旭（1973—），女，遼寧開(kāi)原人，副教授，博士，carol@tust.edu.cn.