微波預處理－溶劑回流提取白芷香豆素類成分的工藝研究

張小維，董自亮，肖丹

點實驗室 中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 610075

白芷為一種常用中藥，中國藥典2005年版收載的白芷為傘形科植物白芷 Angelica dahurica(Fisch．ex Hoffm．)Benth．et Hook．f或杭白芷 Angelica dahurica(Fisch．ex Hoffm．)Benth．et Hook．f．var．formosana(Boiss．)shan et Yuan的干燥根，具有散風除濕、通竅止痛、消腫排膿的作用，臨床廣泛應用于感冒頭痛、眉棱骨痛、鼻塞、鼻淵、牙痛、白帶和瘡瘍腫痛等癥，并有較好的療效［1］。白芷中香豆素類為其鎮痛的主要成分，又以歐前胡素、異歐前胡素和氧化前胡素為其主要成分，其止痛效果已被充分肯定［2］。白芷中香豆素含量的高低，是中藥白芷品質評價的重要指標之一。

微波預處理過程中微波作用的是剛好被汽化劑濕潤的物料，微波幾乎全被物料吸收，處理時間只有幾十秒，由于處理時間短，微波對目標產物的破壞輕，提取效果好［3－5］。本文采用微波預處理的方法［6］，該法在半干狀態下，先用微波輻射破壞植物細胞結構，然后采用傳統法進行提取，在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗法對微波預處理提取工藝進行了優化，得出了最佳參數組合。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀(島津LC－2010 AHT，島津Class vp色譜工作站);旋轉蒸發儀(R－205，上海申勝生物技術有限公司);電子天平(BP－211D，Sartorius，德國);超聲波清洗器(KQ－300E，昆山市超聲儀器有限公司);微波爐(MM721AAU－PW，佛山市順德區美的微波電器制造有限公司);循環水式真空泵(SHB－3，鄭州杜甫儀器廠);微型植物粉碎機(FZ102，天津市泰斯特儀器有限公司)，等。

1.2 材料

白芷藥材于2009年11月采自四川省遂寧市，經成都中醫藥大學馬逾英教授鑒定為傘形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch．ex Hoffm．)Benth．et Hook．f的干燥根，符合中國藥典2005年版一部白芷項下的有關規定，陰干，粉碎成不同大小的粉末，備用。所用甲醇、乙醇等化學試劑均為分析純，水為雙蒸水。

2 實驗方法

2.1 提取方法

2.1.1 傳統提取

取白芷粉末10 g，加入75%乙醇60 mL，回流提取2次，每次提取60 min，過濾，合并濾液，待用。

2.1.2 微波預處理提取

2.1.2.1 稱取10 g白芷藥材粗粉于表面皿中，滴加一定量汽化劑(一定濃度的乙醇溶液)使之濕潤均勻，然后鋪平，厚度在3～5 mm左右，靜置一段時間，使溶液充分滲入細胞組織內。

2.1.2.2 將濕潤好的白芷粉末放入微波爐中進行快速加熱預處理，使滲入細胞組織內的乙醇溶液快速汽化。

2.1.2.3 將上述處理過的白芷粉末，加60 mL乙醇后，回流提取60 min，趁熱過濾，提取2次，合并濾液至200 mL量瓶中。藥渣用乙醇洗滌2～3次，并入濾液，放冷，定容，搖勻，備用。

2.2 白芷中歐前胡素含量測定及方法學考察

2.2.1 色譜條件

色譜柱為 Dikma C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);檢測波長:300 nm;流動相:甲醇－水(70∶30);流速:1 mL·min－1;柱溫:30 ℃;進樣量:10 μL;理論塔板數按歐前胡素峰計算應不低于3000(圖1)。

圖1 歐前胡素對照品(A)與白芷提取液(B)的HPLC圖

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取歐前胡素對照品4.82 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密量取白芷提取液1 mL，加甲醇定容至10 mL，搖勻，進樣前經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.4 標準曲線的繪制

分別精密吸取 10 μL 不同濃度(4.82、9.64、19.28、28.92、38.56、48.20 μg·mL－1)的對照品溶液，按上述色譜條件測定，以峰面積與質量濃度進行線性擬合，得線性方程為Y=6054.7457X+5028.1397，(r=0.999 9，n=6)。結果表明，歐前胡素對照品溶液在4.82 μg·mL－1～ 48.20 μg·mL－1的濃度范圍內具有良好的線性關系。

2.2.5 精密度實驗

精密吸取同一對照品溶液10 μL，連續進樣6次，按上述色譜條件測定，結果歐前胡素峰面積的RSD為1.70%。

2.2.6 穩定性實驗

精密稱取同一對照品溶液，分別在 0、2、4、6、8 h測定，按上述色譜條件測定，得出RSD為1.62%，表明被測物在8 h內基本穩定。

2.2.7 重現性實驗

同一批號白芷藥材按照“2.2.3”項下方法平行制備5份，測定RSD為1.91%，表明方法的重復性良好。

2.2.8 加樣回收率實驗

分別精密稱取同一白芷藥材粉末約0.2 g(約含有歐前胡素0.42 mg)9份，分成高、中、低3組，精密加入相當于樣品中含量50%、100%、150%的歐前胡素對照品，按照“2.2.3”項下平行制備供試品溶液，計算得平均回收率為100.74%，RSD為1.29%(表1)。

表1 加樣回收試驗測定結果

2.2.9 樣品含量測定

取白芷提取液樣品，平行制備3份供試品，分別吸取10 μL進行測定，計算得提取液中歐前胡素的含量為0.21%(n=3)。

3 結果與分析

3.1 微波預處理汽化劑濃度的影響

稱取白芷粉末5份，分別加入2.5 mL· g－1不同濃度(40%、50%、60%、70%、80%)的乙醇，微波輻射150 s，75%乙醇60 mL回流提取2次，每次40 min，提取結果見圖2。

圖2 汽化劑濃度對歐前胡素提取率的影響

實驗中采用乙醇溶液作為預處理汽化劑，從圖2可知，乙醇濃度不同，提取率也不同，這與乙醇溶液滲透白芷藥材細胞膜效果不同相關，滲透細胞膜效果越好，微波對細胞壁的破壞效果越好，提取率也越高。圖2表明乙醇濃度為60%時，歐前胡素含量達最大值，說明此時乙醇溶液滲透白芷細胞膜效果最好。

3.2 微波汽化劑用量的影響

稱取白芷粉末 5 份，分別加入 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0倍量的60%乙醇，微波輻射150 s，75%乙醇60 mL回流提取2次，每次40 min，提取結果見圖3。

圖3 汽化劑用量對歐前胡素提取率的影響

從圖3中可看到，隨汽化劑用量增加，提取率也增加，到達最大值后，提取率隨汽化劑用量增加反而減少。可能原因是:當微波汽化劑用量少時，汽化不充分，同時在一定微波輻射量下汽化劑被蒸干，易導致物料溫度過高，細胞被破壞過度，造成部分有效成分損失，影響提取得率;而當汽化劑用量過大時，在一定微波輻射量下，多余的汽化劑蒸發，消耗了微波能，使滲透到細胞內的汽化劑汽化不充分，造成物料溫度低，細胞壁破壞不夠，提取率不高。圖3表明，汽化劑用量為2.5倍量，即2.5 mL· g－1時，提取效果最佳。

3.3 微波預處理時間的影響

以60%乙醇2.5 mL· g－1為汽化劑，分別微波預處理60、90、120、150、180 s，然后用75%乙醇60 mL 回流提取2次，每次40 min。提取結果見圖4。

圖4 微波輻射時間對歐前胡素提取率的影響

從圖4可知，隨輻射時間延長，提取率逐漸提高，至150 s時達最大后，提取率迅速下降，存在一個最佳的微波輻射時間。這是由于隨著輻射時間增加，物料逐步變干，溫度不斷上升，細胞被破壞程度逐漸增加，提取率也不斷提高;但微波破壞細胞的同時，也會破壞有效成分，輻射時間越長，有效成分損失越多，而且細胞粉碎過細也會造成內傳質阻力增大，引起提取率下降。在輻射功率一定的條件下，控制微波輻射時間是為了控制加熱程度，以獲得最大提取率。圖4表明，本實驗微波輻射的最佳時間為150 s。

3.4 正交試驗優化微波預處理工藝參數

在單因素試驗基礎上，選取汽化劑用量(A)、汽化劑濃度(B)和微波輻射時間(C)，三個因素分別取三水平進行正交試驗，見表2;以白芷歐前胡素的含量為考核指標，用L9(34)正交表安排試驗，結果及方差分析見表3、表4。

表2 微波預處理影響因素水平表

表3 正交試驗及結果

表4 方差分析表

由極差及方差分析結果可知，影響因素的大小順序C＞A＞B，微波預處理最優工藝為 C3A3B2，即:微波汽化劑為60%乙醇，用量為物料的2.5倍(mL·g－1)，微波輻射 150 s。

3.6 后續提取時間的影響

以2.5 mL· g－1的60%乙醇為汽化劑，微波輻射150 s，用75%乙醇60 mL回流提取2次，每次分別提取20、30、40、50、60 min 時所得歐前胡素的含量(圖5)。

與傳統的醇提相似，歐前胡素含量隨提取時間的增加而上升，但提取40 min以后含量增加不明顯，考慮到實際生產情況，確定后續提取時間為40 min。

圖5 后續提取時間對歐前胡素提取率的影響

3.7 后續提取溶劑濃度的影響

以60%乙醇為汽化劑，用量2.5 mL·g－1，微波輻射150 s，分別以55%、65%、75%、85%、95%乙醇60 mL回流提取2次，每次提取40 min，結果見圖6。

圖6 后續提取溶劑的濃度對歐前胡素提取率的影響

從圖6可知，當后續提取乙醇濃度為75%時，白芷歐前胡素的提取效果最佳。

3.8 微波預處理法與傳統提取比較

按最優微波預處理條件和確定的后續提取條件，進行白芷歐前胡素提取，結果含量為0.211%，在正交試驗結果中較高，表明篩選出來的最適條件可信。微波預處理法與傳統提取法進行比較，結果見表5。微波預處理提取法所用時間只有傳統提取法的一半，歐前胡素的提取率提高1.11%左右;說明經過微波預處理后，后續提取時間縮短，提取速度大大加快，方法具有可行性。

表5 微波預處理提取法與傳統提取法比較

4 結論

4.1 本課題組通過白芷提取工藝的正交試驗研究以及對汽化劑乙醇濃度、用量和微波處理時間的深入探討，確定了微波預處理提取白芷中歐前胡素的最佳工藝參數為:以60%乙醇為汽化劑，用量為2.5 mL· g－1，輻射時間150 s，75%乙醇常規回流提取2次，每次40 min;運用該法所得歐前胡素含量可達到0.211%。

4.2 本研究是在半干狀態下，先用微波輻射破壞植物細胞結構，然后進行傳統法提取。由于微波作用的是剛好被汽化劑濕潤的物料，微波幾乎全被物料吸收，處理時間短，微波對目標產物的破壞小，提取效果好，為后續的工藝帶來了方便，有著廣闊的發展前景。

［1］ 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(一部)［S］．北京:化學工業出版社，2005:69．

［2］ 魏玉平，劉俊，顏小林，等．白芷治療頭痛的提取工藝評判指標的研究［J］．中草藥，2001，32(4):318．

［3］ 張英，俞卓裕，吳曉琴．中草藥和天然植物有效成分提取新技術－微波協助萃取［J］．中國中藥雜志，2004，29(2):104．

［4］ 黎海彬，王邕，李俊芳，等．微波輔助提取技術在天然產物提取中的應用［J］．現代食品科技，2005，21(3):148．

［5］ 謝明勇，陳奕．微波輔助萃取技術研究進展［J］．食品與生物技術學報，2006，25(1):105．

［6］ ZHANG Z，XIONG G，LIE G，HE X．Sample pretreatment with microwave－assisted techniques［J］．Anal Sci，2000，16，(2):221．