低溫果膠酶的純化及酶的化及酶學性質的研究

王 偉，李 鋒，張 磊，茆 軍

(1.新疆農業大學食品科學學院，新疆烏魯木齊830052;2.新疆農業大學化工學院，新疆烏魯木齊830052;3.新疆農業大學教務處，新疆烏魯木齊830052;4.新疆農業科學院微生物研究所，新疆烏魯木齊830091)

低溫果膠酶的純化及酶的化及酶學性質的研究

王 偉1，李 鋒2，張 磊3，茆 軍4

(1.新疆農業大學食品科學學院，新疆烏魯木齊830052;2.新疆農業大學化工學院，新疆烏魯木齊830052;3.新疆農業大學教務處，新疆烏魯木齊830052;4.新疆農業科學院微生物研究所，新疆烏魯木齊830091)

進行了低溫果膠酶產生菌的篩選，并對低溫果膠酶的酶學性質、純化及動力學常數進行了研究。結果表明:該酶最適酶反應溫度25℃，最適酶反應pH為5.8;酶液的pH穩定范圍在5～6.4;在25℃保溫3h，酶活降至50.5%，在35℃保溫2h，酶活降至55.1%，在45℃保溫1.5h，酶活降至48.7%，在55℃保溫1h，酶活降至43.1%;金屬離子Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Na+對低溫果膠酶有激活作用，而Ba2+、Hg2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+對低溫果膠酶有強烈的抑制作用;當以果膠為底物時，該酶的動力學常數Km為27.86mg/mL，Vmax為152.13μmol/(min·mL);采用不同的處理方法均可使低溫果膠酶得到純化，但40%～85%的硫酸銨分級沉淀純化效果最好。

低溫果膠酶，最適酶反應溫度，最適酶反應pH，分離純化

果膠，化學名聚半乳糖醛酸，主要是由D－半乳糖醛酸以α－1，4糖苷鍵連接形成的直鏈狀聚合物，是植物體中一類復雜的膠體性多糖類，是植物細胞壁的組成成分，填充在植物的細胞壁之間，具有使細胞粘合在一起的作用［1］。果膠經果膠酶分解后，植物細胞便分離。果膠酶是分解果膠質的多種酶的總稱，果膠酶可分為兩大類:解聚酶和果膠酯酶［2－4］。果膠酶主要運用于果汁提取、果汁澄清、果酒澄清與過濾、果實脫皮、紡織工業麻類脫膠、畜牧業的飼料添加劑及中藥營養液的深加工等。面對當今世界社會發展的重大問題(如糧食短缺、資源枯竭、生態環境惡化)，本實驗開展了低溫果膠酶的研究，旨在利于節約能源，保護環境，并在降低生產成本等方面發揮積極作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種 由實驗室從采集的土樣中分離得到;富集培養基 牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，K2HPO40.1%，KH2PO40.03%，橘皮粉2%，pH7;初篩平板培養基果膠0.1%，牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，K2HPO40.1%，KH2PO40.03%，瓊脂2%，pH7;基礎發酵培養基 橘皮粉2%，硫酸銨0.2%，酵母膏0.5%，K2HPO40.2%，MgSO40.2%，NaCl0.1%，MnSO40.00025%，FeSO40.00075%，pH7;種子培養基 麥芽膏0.3%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.3%，葡萄糖1.0%，pH6.5。

541 7R型高速冷凍離心機，FA2104型電子天平，LDZX－40BI型高壓滅菌鍋，GKC型數顯控溫水浴鍋，THZ－82恒溫振蕩器，SW－CJ－IC型超凈工作臺，DHG－9140A型恒溫培養箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 技術路線 采樣→富集培養→初篩→復篩→酶學特性研究

1.2.1.1 初篩 將富集培養液稀釋涂布于初篩平板上，25℃培養6d左右，加1%(W/V)的十六烷基三甲基溴化銨，靜置，菌落周圍出現透明圈的為產果膠酶的菌株。

1.2.1.2 復篩 將初篩后得到的菌株接入液體種子培養基，搖瓶培養15h后接種于液體發酵培養基上，在溫度為25℃，150r/min恒溫振蕩器培養96h，取粗酶液測定果膠酶活性。

1.2.1.3 酶活力的測定 依據文獻［5］，以Sigma公司的桔子果膠為底物，用次亞碘酸法定量測定，所生成的半乳糖醛酸量表示果膠酶的活力。酶活力的定義為:在pH5.8，25℃下，1h酶促化果膠分解生成1mg游離半乳糖醛酸所需的酶量定義為一個酶活性單位。

1.2.2 低溫果膠酶酶學性質研究

1.2.2.1 低溫果膠酶最適酶反應溫度的測定 在pH為3.5的條件下，取不同溫度，分別測定粗酶液的酶活力，確定最適酶反應溫度。

1.2.2.2 低溫果膠酶的溫度穩定性 將酶液在不同溫度下分別放置30min，在pH為3.5，溫度為25℃的條件下，測定殘余酶活力，確定酶活穩定溫度范圍。

1.2.2.3 低溫果膠酶熱穩定性 將酶液分別置于不同溫度下，每隔30min測定殘余酶活力，確定酶熱穩定性曲線。

1.2.2.4 低溫果膠酶的最適酶反應pH 分別配制不同pH的緩沖液，在25℃條件下，分別測定粗酶液的酶活力，確定最適酶反應pH。

1.2.2.5 低溫果膠酶的穩定pH范圍測定 用不同pH的緩沖液與粗酶液分別按4∶1體積混合，4℃保存12h。分別測定酶活力，確定最適酶反應pH范圍。

1.2.2.6 金屬離子對低溫果膠酶酶活力的影響 將不同金屬鹽用pH為5.8的檸檬酸－檸檬酸納緩沖液溶解，配制成物質量濃度為2mmol/L的含金屬鹽的緩沖液，在25℃分別測定粗酶液的活力。

1.2.2.7 低溫果膠酶的動力學常數的測定［6］采用Lineweave－Burk雙倒數法作圖，求得Km與Vmax。

1.2.3 低溫果膠酶粗酶液的純化 將粗酶液分別采用硫酸銨一次沉淀法、SephadexG2－100凝膠過濾法和DEAE52－cellulose離子交換層析法進行分離純化，并分別測定酶液中蛋白質的含量和酶活力。

2 結果與分析

2.1 果膠酶產生菌的篩選

表1 低溫果膠酶產生菌篩選結果

從采集的土樣中經過富集培養、初篩，挑選在篩選平板上生長速度快并產生明顯透明圈，且H/C(H為透明圈直徑，C為菌落直徑)大的菌株搖瓶發酵進行復篩。最后得到6株產酶特性較佳的菌株，其中一株生長較快，經反復培養產酶特性穩定，菌種定名為LP272，并以其為研究菌株進行果膠酶酶學特性的初步研究。

2.2 菌株LP272的生化鑒定

菌株LP272經生化鑒定儀鑒定后，結果如表2。

表2 菌株LP272生化鑒定結果

通過VITEK32自動鑒定儀測定，其結果為指甲隱球酵母(Cryptococcus nuiguttulatus)。

2.3 低溫果膠酶酶學性質研究

2.3.1 低溫果膠酶最適酶反應溫度的測定 結果如圖1。

圖1 最適酶反應溫度曲線

由圖1可知，菌株LP272所分泌的低溫果膠酶的最適酶反應溫度為25℃，且為低溫果膠酶。該酶在不同溫度下進行反應時，呈現出較為典型的鐘形曲線。

2.3.2 低溫果膠酶的溫度穩定性 結果如圖2。

由圖2可知，菌株LP272所分泌的低溫果膠酶在25℃以下保存時，酶活性變化不大。在30℃的條件下保存30min，酶活力仍然保留了95.2%，即使當溫度達到50℃時，酶活性還保留了65%，這一現象說明菌株LP272所分泌的低溫果膠酶對常溫有一定的抵抗能力。

2.3.3 低溫果膠酶的熱穩定性 結果如圖3。

圖2 酶的溫度穩定性曲線

圖3 酶的熱穩定性曲線

由圖3可知，菌株LP272所分泌的低溫果膠酶，在25℃保溫3h，酶活力降低至50.5%;35℃保溫2h，酶活力降低至50.1%;45℃保溫1.5h，酶活力降低至48.7%;55℃保溫1h，酶活力降低至43.1%。

2.3.4 低溫果膠酶最適酶反應pH的確定 結果如圖4。

圖4 最適酶反應pH曲線

由圖4可知，菌株LP272所分泌的低溫果膠酶在酶反應pH為5.8時酶活力最高。當pH小于5.8時，隨著緩沖液酸性的減弱，酶活力逐漸變大;但當pH大于5.8時，酶活力顯著減小，當緩沖液顯堿性時，酶活力繼續下降。2.3.5 低溫果膠酶的穩定 pH范圍測定 結果如圖5。

圖5 酶的穩定pH范圍曲線

由圖5可知，菌株LP272所分泌的低溫果膠酶pH穩定范圍在pH5～6.4，當pH達到7.0時，酶活力保留了55.7%，pH達到8.0時，酶活力只保留了25.1%，說明堿性環境不利于低溫果膠酶的保存。

2.3.6 金屬離子對低溫果膠酶酶活力的影響 結果如圖6。

圖6 金屬離子對酶活力的影響

由圖 6可知，Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Na+對低溫果膠酶有激活作用，其作用大小的順序為Ca2+> Mg2+>Zn2+>Mn2+>Fe2+>Na+，而 Ba2+、Hg2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+對低溫果膠酶有強烈的抑制作用，其作用大小的順序為Hg2+>Pb2+>Cu2+>Fe3+>Ba2+。

2.3.7 低溫果膠酶的動力學常數 將果膠分別配制成濃度為5、10、15、20、30mg/mL，在25℃、pH5.8的條件下，測定酶活力，利用Lineweave－Burk雙倒數法作圖求出低溫果膠酶的動力學常數，結果如圖7。

圖7 以果膠為底物的Lineweave－Burk圖

利用公式:1/V=1/Vmax+(Km/Vmax)·(1/［S］)，求出低溫果膠酶的動力學常數，當以果膠為底物時，Km為27.86mg/mL，Vmax為152.13μmol/(min·mL)。2.3.8 低溫果膠酶的分離純化 結果如表3。

表3 分離純化結果

由表3可知，采用不同的處理方法均使低溫果膠酶得到純化。但綜合純化倍數、比活力及回收率三項指標，40%～85%的硫酸銨分級沉淀純化效果最好，純化倍數為2.449倍，比活力為691.86U/mg，回收率為86.97%。

3 結論

從采集的土樣中篩選到一株產低溫果膠酶的菌株LP272，經鑒定該菌屬于指甲隱球酵母。其產生的低溫果膠酶最適酶反應溫度為25℃，最適酶反應pH為pH5.8;粗酶液在25℃保溫3h，酶活降至50.5%，在35℃保溫2h，酶活降至50.1%，在45℃保溫1.5h，酶活降至48.7%，在55℃保溫1h，酶活降至43.1%;該酶的pH穩定范圍在pH5～6.4;金屬離子 Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Na+對低溫果膠酶有激活作用，而Ba2+、Hg2+、Cu2+、Fe3+、Pb2+對低溫果膠酶有強烈的抑制作用;當以果膠為底物時，該酶的動力學常數Km為27.86mg/mL，Vmax為152.13μmol/(min·mL);采用不同的處理方法均使低溫果膠酶得到純化，但40%～85%的硫酸銨分級沉淀純化效果最好。

［1］郭愛蓮，張紅蓮，馮琛.某些物質對細菌Xg－02果膠酶活性的影響［J］.西北輕工業學院學報，2001，19(1):18－21.

［2］張樹政.酶制劑工業(下)［M］.北京:科學出版社，1984:625－634.

［3］江潔，劉曉蘭，等.果膠酶活性分光光度測定方法的研究［J］.齊齊哈爾大學學報，1998，14(1):63－66.

［4］Alkorta L，Garbisu G，Llama MJ，et al.Industrial application of pectic enzymes:a review［J］.Process Biochem，1998，33:21－28.

［5］郭愛蓮，王少輝，劉忠.產果膠酶芽孢桿菌Xg－01的分離、篩選及發酵條件的研究［J］.西北大學學報:自然科學版，1997(2):53－56.

［6］Ullah A H J.Prep Biochem［J］，1998，18:443－458.

Study on purification and characteristics of the cold adapted pectinase

WANG Wei1，LI Feng2，ZHANG Lei3，MAO Jun4
(1.College of Food Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China;2.College of Chemical Engineering，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China;3.Academic Affairs Office，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China;4.Institute of Microbiology，Xinjiang Academy of Agricultural Science，Urumqi 830091，China)

The strain producing cold adapted pectinase was screened，and the characteristics of cold adapted pectinase，purification and kinetic constant were studied.The results showed that:the optimal temperature and pH for the enzyme reaction was 25℃ and 5.8，the enzyme was stable at pH5～6.4，after 3h at 25℃，the enzyme activity was 50.5%，at 35℃for 2h，the enzyme activity was 55.1%，at 45℃ for 1.5h，the enzyme activity was 48.7%，at 55℃ for 1h，the enzyme activity was 43.1%.The metal ion Mg2+，Ca2+，Mn2+，Zn2+，Fe2+，Na+enhanced the cold adapted pectinase activity，but the metal ion Ba2+，Hg2+，Cu2+，Fe3+，Pb2+inhibited the cold adapted pectinase activity strongly.The kinetic constant of the cold adapted pectinase was Km value 27.86mg/mL and Vmax 152.13μmol/(min·mL)when pectin(sigma)as a substrate.The cold adapted pectinase was purified by ammonium sulfate salted out and the optimal range of ammonium sulfate saturation was 40%～85%.

cold adapted pectinase;the optimal temperature for the enzyme reaction;the optimal pH for the enzyme reaction;purification

TS201.2+5

A

1002－0306(2011)04－0162－04

2009－10－10

王偉(1978－)，男，講師，研究方向:微生物發酵工程。